基于雙五氟芐基硫醚的氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定大鼠腦組織中的H2S

王 秀，汪 生，陳志武

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，2.科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230032)

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認(rèn)為是繼一氧化碳(carbon monoxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[1]，多年的科學(xué)研究揭示腦組織中存在生理濃度的H2S，并參與了心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等機(jī)體的生理功能調(diào)節(jié)和病理過(guò)程。內(nèi)源性H2S主要由酶促反應(yīng)產(chǎn)生，可通過(guò)胱硫醚-β-合成酶(l-cystathionine-β-synthetase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(l-cystathionine-γ-lyase，CSE)催化半胱氨酸(l-cysteine，L-Cys)生成。另外，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)也可生成H2S[2]。腦組織中含有豐富的H2S合酶，如CBS和3-MST，產(chǎn)生的H2S可起到神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)而參與學(xué)習(xí)和記憶功能的調(diào)劑，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)[3-4]，通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷和抗細(xì)胞凋亡等產(chǎn)生較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用[4-6]。

在H2S的神經(jīng)生物學(xué)作用研究中，腦組織中H2S的檢測(cè)是至關(guān)重要的。目前，測(cè)定生物樣品中H2S濃度的方法主要有亞甲基藍(lán)分光光度法[7]、頂空氣相色譜法[8]、反相高效液相色譜法[9]和熒光探針?lè)╗10]。其中，亞甲基藍(lán)法簡(jiǎn)單快速，是檢測(cè)水和非生物性樣品中H2S濃度的最常用的方法。但其敏感性較差，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生成了其他的有色物質(zhì)，可能對(duì)665 nm處檢測(cè)的吸收峰產(chǎn)生影響，使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生誤差；頂空氣相色譜法實(shí)驗(yàn)不成熟，難以用于實(shí)踐；反相高效液相色譜法的準(zhǔn)確性易受到氧濃度的影響，定量分析有一定難度；熒光探針?lè)ň哂休^高的靈敏度和選擇性，但其穩(wěn)定性低且成本過(guò)高。Kage等[11]報(bào)道在堿性條件下，將血液中H2S轉(zhuǎn)化為硫離子(S2-)后，用五氟卞基溴(pentafluorobenzyl bromide，PFBBr)衍生化成雙五氟芐基硫醚(bispentafluorobenzyl sulfide，C6F5CH2SCH2C6F5)，采用氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chr-omatograph-mass spectrometry，GC-MS)檢測(cè)C6F5CH2SCH2C6F5來(lái)確定H2S濃度。目前認(rèn)為該方法敏感性和特異性均較好，是檢測(cè)血液樣本中H2S的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。由于蛋白質(zhì)中含硫的氨基酸也可產(chǎn)生釋放S2-，并且腦組織比血液含有更多的蛋白質(zhì)，該方法能否檢測(cè)腦組織中H2S尚未見文獻(xiàn)研究報(bào)道。因此，本研究?jī)?yōu)化了腦組織樣品的前處理和PFBBr衍生化反應(yīng)的條件，建立腦組織中H2S的GC-MS測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器 安捷倫7890B-7000D型氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀，由美國(guó)Agilent公司出品；XW-80C型旋渦混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠出品；XPE205型分析天平，瑞士ETTLER TOLEDO公司出品；Milli-Q Integral型超純水系統(tǒng)，由美國(guó)Millipore公司出品。

1.1.2藥品與試劑 硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)、甲醇(methanol，HPLC級(jí)，純度≥99.9%)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為#SHBL6872V和#WXBD4144V；四硼酸鈉(sodium tetraborate，Na2B4O7, 純度>99.5%)，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：L11197038；五氟卞基溴(pentafluorobenzyl bromide，PFBBr, 純度為98%)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(tetradecyl dimethyl benzyl ammoniumchloride，TDMBA, 純度為99%)和1,3,5-三溴苯(1,3,5-tribromobenzene, TBB, 純度>98%)，均購(gòu)自中國(guó)百靈威科技有限公司，批號(hào)分別為L(zhǎng)950U31、L360U66和L9A0T55；磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4, 純度≥99.5%)、乙酸乙酯(HPLC級(jí), 純度≥99.8%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為20181209和20200617。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠(SPF級(jí))，160～200 g，全部由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)良好，飼養(yǎng)溫度為(22±3) ℃。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(皖)2017-001。

1.2 GC-MS測(cè)定方法

1.2.1溶液配制 飽和Na2B4O7溶液：稱取1.5 g Na2B4O7，加入到250 mL無(wú)氧水中(超純水煮沸10 min，冷卻至室溫)，加熱溶解，冷卻至室溫后超聲，取上層清澈溶液。TDMBA溶液：稱取TDMBA 92.0 mg，加入50 mL飽和Na2B4O7溶液中溶解。NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液：稱取NaHS標(biāo)準(zhǔn)品56.0 mg，加入1 mL飽和Na2B4O7溶液溶解后，稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。PFBBr溶液：稱取PFBBr 104.4 mg，加入40 mL乙酸乙酯溶解。內(nèi)標(biāo)TBB溶液：稱取TBB 8.0 mg，加入10 mL乙酸乙酯，溶解后得到800 μg·L-1的溶液，臨用時(shí)稀釋成4 μg·L-1。飽和KH2PO4：稱取11.0 g KH2PO4，加入到50 mL無(wú)氧水中，加熱溶解，冷卻至室溫后超聲，取上層無(wú)晶體溶液。

1.2.2測(cè)定原理 在堿性條件下，H2S轉(zhuǎn)化為HS-后，被PFBBr衍生化生成C6F5CH2SCH2C6F5。通過(guò)氣相色譜分離和質(zhì)譜定性后，用C6F5CH2SCH2C6F5的選擇離子質(zhì)荷比(m/z)與TBB的選擇離子質(zhì)荷比(m/z)的峰面積比定量分析。

1.2.3色譜條件 采用HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細(xì)管柱；色譜柱程序升溫：起始溫度為100 ℃，保持1.5 min后，以40 ℃·min-1上升到280 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；載氣為氦氣，速度為1.0 mL·min-1；分流比為10 ∶1；進(jìn)樣量0.5 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源，電子能量20 eV。離子源溫度為230 ℃，接口溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃，采用MRM模式。內(nèi)標(biāo)TBB的一級(jí)母離子是314(m/z)，定量離子對(duì)為m/z 314→235，定性離子對(duì)為m/z 207→191。目標(biāo)衍生物C6F5CH2SCH2C6F5的一級(jí)母離子是394(m/z)，定量離子對(duì)為m/z 394→181，定性離子對(duì)為m/z 181→161。

1.2.5腦組織樣品的處理和衍生化反應(yīng) 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭取腦，稱取0.1 g雙側(cè)大腦皮質(zhì)組織浸入0.9 mL飽和Na2B4O7溶液中勻漿90 s。吸取200 μL腦組織勻漿液，加入1倍量甲醇沉淀蛋白，震蕩混勻1 min，離心10 min(12 000 r·min-1,4 ℃)。

取300 μL離心的上清液加入到玻璃試管中，依次加入0.8 mL TDMBA溶液、0.5 mL PFBBr溶液和1.0 mL TBB溶液，震蕩混勻2 min。置搖床(250 r·min-1，25 ℃)中反應(yīng)1 h，加入1.0 mL飽和KH2PO4溶液，震蕩混勻1 min，吸取上層有機(jī)相離心10 min(12 000 r·min-1)，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，以待進(jìn)行后續(xù)的GC-MS檢測(cè)。

1.2.6方法學(xué)驗(yàn)證 在預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，分別考察GC-MS測(cè)定H2S方法的選擇性、線性關(guān)系與檢測(cè)限、準(zhǔn)確度與精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)以及穩(wěn)定性等。

1.3 大鼠NaHS給藥后，腦組織中H2S濃度的測(cè)定將SD大鼠按隨機(jī)原則分為4組，即生理鹽水(NS)對(duì)照組、NaHS 1.4、2.8和5.6 mg·kg-13個(gè)劑量組，每組6只大鼠，雌雄各半。各組大鼠分別尾靜脈注射NS或各劑量NaHS，0.5 h后，斷頭取腦，分離雙側(cè)腦皮質(zhì)組織并按“1.2.5 腦組織樣品的處理和衍生化反應(yīng)”方法處理后，待GC-MS檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 色譜分離和質(zhì)譜定性

2.1.1色譜分離 取64 μmol·L-1的NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液和NaHS終濃度為64 μmol·L-1的大鼠腦勻漿各200 μL，按前述方法經(jīng)PFBBr衍生化后，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。如Fig 1所示，NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液和加NaHS的大鼠腦勻漿中TBB波峰和C6F5CH2SCH2C6F5波峰的峰形良好，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間均為4.8 min，C6F5CH2SCH2C6F5出峰時(shí)間均為5.4 min。

Fig 1 Chromatogram of TBB and C6F5CH2SCH2C6F5TBB was used as internal control. Retention time was 4.8 min for TBB and 5.4 min for C6F5CH2SCH2C6F5. A: 64 μmol·L-1 NaHS standard solution; B: Rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1.

2.1.2質(zhì)譜定性 如Fig 2所示，TBB特征離子有m/z 314和m/z 235，C6F5CH2SCH2C6F5特征離子有m/z 394和m/z 181。參考文獻(xiàn)的方法[13]，選擇m/z 314→235子離子對(duì)定量測(cè)定TBB和m/z 394→181子離子對(duì)定量測(cè)定C6F5CH2SCH2C6F5。

Fig 2 Mass spectra of TBB and C6F5CH2SCH2C6F5TBB was used as internal control. A: TBB; B: C6F5CH2SCH2C6F5

2.2 衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1PFBBr濃度 配制1、5、10和20 mmol·L-1的PFBBr系列濃度溶液，分別與含100 μmol·L-1NaHS的腦勻漿液衍生化反應(yīng)后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。結(jié)果如Fig 3A所示，PFBBr濃度在1～10 mmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比隨PFBBr濃度增加而增大(P<0.01)。加入20 mmol·L-1PFBBr溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)，峰面積比略有減小，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)的衍生化反應(yīng)采用10 mmol·L-1的PFBBr。

Fig 3 Optimization of derivatization reaction n=3)A: PFBBr concentration (**P<0.01 vs 10 mmol·L-1); B: Temperature of derivatization reaction(*P<0.05 vs 25 ℃); C: Time of derivatization reaction.(*P<0.05 vs 60 min).

2.2.2衍生化反應(yīng)溫度和時(shí)間 為確定衍生化反應(yīng)的最佳溫度，將10 mmol·L-1的PFBBr加入含100 μmol·L-1NaHS的腦勻漿液中分別置25、35和45 ℃ 3個(gè)溫度下進(jìn)行60 min的衍生化反應(yīng)后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。Fig 3B顯示，25 ℃時(shí)C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比最大，35 ℃時(shí)的峰面積比與25 ℃時(shí)的相比略有減小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。45 ℃時(shí)的峰面積比與25 ℃時(shí)的相比明顯減小(P<0.05)。

將10 mmol·L-1的PFBBr加入含100 μmol·L-1NaHS的腦勻漿液中于25 ℃下分別反應(yīng)30、60和120 min后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。Fig 3C表明反應(yīng)進(jìn)行60 min時(shí)，C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比最大。衍生化反應(yīng)30 min與反應(yīng)60 min相比，峰面積比明顯減小(P<0.05)。衍生化反應(yīng)120 min與反應(yīng)60 min相比，峰面積比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)在25 ℃中進(jìn)行60 min的衍生化反應(yīng)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1水溶液中H2S的測(cè)定

2.3.1.1 選擇性 分別取不加內(nèi)標(biāo)TBB的飽和Na2B4O7溶液(用乙酸乙酯代替TBB)、加TBB的飽和Na2B4O7溶液和加TBB的64 μmol·L-1NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液各200 μL，衍生化反應(yīng)后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。Fig 4色譜圖顯示，加TBB的飽和Na2B4O7溶液和NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液均出現(xiàn)了明顯的TBB特征波峰，NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液出現(xiàn)了明顯的C6F5CH2SCH2C6F5波峰，TBB與C6F5CH2SCH2C6F5的保留時(shí)間分別為4.8 min和5.4 min，兩者分離完全，峰形良好。不加TBB的飽和Na2B4O7溶液既未出現(xiàn)TBB波峰，也未出現(xiàn)C6F5CH2SCH2C6F5波峰。結(jié)果表明本方法對(duì)H2S的測(cè)定具有明顯的選擇性。

Fig 4 Selectivity of method for detecting H2S in aqueous solution(GC-MS method)Peak at 4.8 min was for internal control TBB and peak 5.4 min was for C6F5CH2SCH2C6F5. A: Chromatogram of Na2B4O7 solution without TBB; B: Chromatogram of Na2B4O7 solution with TBB; C: Chromatogram of 64 μmol·L-1 NaHS standard solution with TBB.

2.3.1.2 線性關(guān)系與檢測(cè)限 配制濃度分別為1、10、25、50、75和100 μmol·L-1的NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.2.5”項(xiàng)下處理后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。以NaHS的濃度為自變量(x)，測(cè)得的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比為因變量(y)做線性回歸分析。得到回歸方程為Y=0.02169X-0.0015(R2=0.9995)，線性范圍為1～100 μmol·L-1。按信噪比S/N≥3，測(cè)得本方法檢測(cè)限(limit of detection，LOD)為0.3 μmol·L-1。

2.3.1.3 準(zhǔn)確度與精密度 配制濃度分別為10、50和100 μmol·L-1的NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行6個(gè)樣品，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)曲，計(jì)算得到各樣品濃度。參照標(biāo)示濃度，利用公式可得準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度。如Tab 1所示，該方法的準(zhǔn)確度為-1.41～5.82，日內(nèi)、日間精密度均<15%，表明本方法測(cè)定水溶液中H2S具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

Tab 1 Accuracy and precision of method for detecting H2S in aqueous solution and rat brain tissues(n=6)

2.3.1.4 穩(wěn)定性 配制10、50和100 μmol·L-1的NaHS標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，每一濃度平行3個(gè)樣品，分別考察NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液在室溫25 ℃下保存24 h和衍生化產(chǎn)物C6F5CH2SCH2C6F5在室溫25 ℃下保存24 h時(shí)的穩(wěn)定性。如Tab 2結(jié)果顯示，NaHS溶液的穩(wěn)定性為44.08%～64.43%，其穩(wěn)定性不好。C6F5CH2SCH2C6F5的穩(wěn)定性為93.41%～98.66%，且RSD<15%，表明C6F5CH2SCH2C6F5在室溫下具有良好的穩(wěn)定性。

Tab 2 Stability of method for detecting H2S in aqueous solution(n=3)

2.3.2大鼠腦組織中H2S的測(cè)定

2.3.2.1 選擇性 分別取空白大鼠腦勻漿液、空白大鼠腦勻漿液(樣品處理過(guò)程中不加甲醇沉淀蛋白)和NaHS終濃度為64 μmol·L-1的大鼠腦勻漿液各200 μL，按上述優(yōu)化條件衍生化反應(yīng)后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。Fig 5顯示3組樣品中均出現(xiàn)了C6F5CH2SCH2C6F5波峰，未加甲醇的腦勻漿樣品中C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比明顯地大于加甲醇的腦勻漿樣品(P<0.01)，加NaHS的腦勻漿樣品中C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比也明顯地大于加甲醇的腦勻漿樣品(P<0.01)。結(jié)果表明該方法對(duì)測(cè)定腦組織中的H2S有明顯的選擇。

Fig 5 Selectivity of method for detecting H2S in rat brain tissue(GC-MS method)Peak at 4.8 min was for internal control TBB and peak 5.4 min was for C6F5CH2SCH2C6F5. A: Chromatogram of blank rat brain homogenate(with methanol); B: Chromatogram of blank rat brain homogenate(without methanol) ; C: Chromatogram of rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1 (with methanol); D: Differences of peak area ratio of C6F5CH2SCH2C6F5 to TBB between blank rat brain homogenate , undeproteinized blank rat brain homogenate and the rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1 n=3). **P<0.01 vs the blank+methanol group.

2.3.2.2 線性關(guān)系與檢測(cè)限 在空白大鼠腦勻漿液中加入NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制NaHS終濃度分別為0.25、1、4、16、64、256 μmol·L-1的系列腦組織樣品，衍生化反應(yīng)后進(jìn)行GC-MS分析。以NaHS終濃度為自變量(x)，加入NaHS后增加的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比為因變量(y)，進(jìn)行線性回歸分析。得回歸方程為y=0.021 11x+0.002 5(R2=0.999)，線性范圍為0.25～256 μmol·L-1。按信噪比S/N≥3，測(cè)得本方法檢測(cè)限(limit of detection，LOD)為0.1 μmol·L-1。

2.3.2.3 準(zhǔn)確度與精密度 配制NaHS終濃度分別為16、64和256 μmol·L-1的腦勻漿樣品，每個(gè)濃度平行配制6個(gè)樣品，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)曲，計(jì)算得到各樣品濃度。參照標(biāo)示濃度，利用公式可得準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度。如Tab 1所示，準(zhǔn)確度為-7.27～4.20，日內(nèi)、日間精密度均<15%。結(jié)果表明該方法測(cè)定腦組織中H2S也具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.3.2.4 回收率 以加入NaHS標(biāo)準(zhǔn)品后腦組織勻漿液中增加的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比，按照上述線性回歸方程計(jì)算回收率。結(jié)果如Tab 3所示，含NaHS 16、64和256 μmol·L-1的腦組織樣品的測(cè)定回收率均在90%以上，表明該方法測(cè)定的回收率良好。

Tab 3 Recovery, matrix effect and stability of method for detecting H2S in rat brain tissues

2.3.2.5 基質(zhì)效應(yīng) 配制NaHS終濃度分別為16、64和256 μmol·L-1的腦勻漿樣品，每個(gè)濃度平行配制6個(gè)樣品，測(cè)得加入NaHS后增加的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比為A1。另用飽和Na2B4O7溶液配制NaHS濃度為16、64和256 μmol·L-1樣品，每個(gè)濃度平行配制3個(gè)樣品，計(jì)算得各濃度C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比均數(shù)為A2。按公式M=A1/A2×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)M。如Tab 3所示，該方法測(cè)得M在93.12%～97.63%之間，表明本方法無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2.6 穩(wěn)定性 配制NaHS終濃度分別為16、64和256 μmol·L-1的腦勻漿樣品，每個(gè)濃度平行配制3個(gè)樣品，衍生化反應(yīng)后立即進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，得到C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比。將反應(yīng)產(chǎn)物于室溫25 ℃放置24 h后，再次測(cè)定峰面積比，計(jì)算其穩(wěn)定性。結(jié)果如Tab 3所示，3個(gè)濃度的NaHS腦組織樣品的衍生化產(chǎn)物在室溫25 ℃保存24 h的穩(wěn)定性在93.49%～97.15%之間，表明該方法測(cè)定在常溫下較為穩(wěn)定。

2.4 靜脈注射NaHS對(duì)大鼠腦皮質(zhì)組織中H2S濃度的影響本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦皮質(zhì)組織中基礎(chǔ)H2S濃度通過(guò)測(cè)定NS組大鼠腦皮質(zhì)組織C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比，根據(jù)NaHS標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。結(jié)果如Fig 6所示，大鼠腦組織中基礎(chǔ)H2S濃度為(11.84±0.38) μmol·L-1。靜脈注射1.4、2.8和5.6 mg·kg-1NaHS后，腦組織中的H2S濃度呈劑量依賴性增加，2.8 mg·kg-1與5.6 mg·kg-1組大鼠腦組織中的H2S濃度與NS對(duì)照組相比有顯著性差異。結(jié)果表明外源性H2S可透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織。

Fig 6 Effect of intravenous injection of NaHS on H2S concentration in rat brain n=6)**P<0.01 vs NS.

3 討論

H2S為多種細(xì)胞產(chǎn)生、釋放的內(nèi)源性氣體[1]，可參與調(diào)節(jié)體內(nèi)許多生理功能和一些病理過(guò)程。當(dāng)pH為7.4時(shí)，體液中的H2S約40%以氣體形式存在，60%以HS-形式存在，但pH為9.5時(shí)，主要以HS-形式存在[14]。弱堿性的飽和Na2B4O7溶液不僅可促進(jìn)H2S轉(zhuǎn)化成HS-，還可提供HS-與PFBBr衍生化反應(yīng)所需的堿性環(huán)境[15]。衍生化反應(yīng)生成的硫衍生物C6F5CH2SCH2C6F5熱穩(wěn)定、揮發(fā)性強(qiáng)、具有強(qiáng)電子捕獲性，適用于GC-MS法檢測(cè)H2S。

在GC-MS法檢測(cè)C6F5CH2SCH2C6F5來(lái)定量腦組織H2S中，HS-與PFBBr的衍生化反應(yīng)條件是十分重要的。本研究對(duì)衍生化反應(yīng)中PFBBr的濃度、反應(yīng)的時(shí)間和溫度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)衍生化反應(yīng)中的PFBBr最適濃度為10 mmol·L-1，最適反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度分別為60 min和25 ℃。

本研究對(duì)C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測(cè)水溶液和大鼠腦組織中H2S的方法學(xué)均進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明該方法不僅對(duì)水溶液中H2S的檢測(cè)具有明顯的選擇性、良好的準(zhǔn)確度和精密度，對(duì)大鼠腦組織中H2S的檢測(cè)也同樣具有選擇性和良好的準(zhǔn)確度、精密度。本文在實(shí)驗(yàn)中觀察到，未加甲醇沉淀蛋白的空白大鼠腦組織中C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比明顯地大于加甲醇的空白大鼠腦組織樣品(P<0.01)。可能是由于腦組織中含有大量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)中含硫的氨基酸釋放S2-，使測(cè)定的峰面積比增加。因此，腦組織樣品處理時(shí)應(yīng)加入甲醇沉淀蛋白，盡可能減小蛋白質(zhì)的S2-對(duì)H2S測(cè)定產(chǎn)生影響。文獻(xiàn)報(bào)道大鼠腦組織中H2S的濃度在幾十到一百多微摩爾每升，該方法檢測(cè)腦組織中H2S的線性范圍為0.25～256 μmol·L-1，LOD為0.1 μmol·L-1，并且不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，可滿足腦組織中H2S的檢測(cè)。因此，C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法是檢測(cè)腦組織中H2S的一種可靠、有效的方法。

在該方法檢測(cè)腦組織中H2S的穩(wěn)定性研究中，將樣品H2S衍生成C6F5CH2SCH2C6F5后在室溫25 ℃下保存24 h，檢測(cè)穩(wěn)定性良好。在水溶液中H2S檢測(cè)穩(wěn)定性研究中，觀察到樣品衍生化生成的C6F5CH2SCH2C6F5在室溫25 ℃下保存24 h，檢測(cè)也具有良好的穩(wěn)定性。但樣品直接在25 ℃下保存24 h，則檢測(cè)穩(wěn)定性較差，這可能與C6F5CH2SCH2C6F5穩(wěn)定性好，而樣品H2S易于揮發(fā)溢出有關(guān)[16]。因此，應(yīng)用C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測(cè)H2S時(shí)，應(yīng)在采樣后盡快或衍生反應(yīng)完成24 h內(nèi)完成檢測(cè)，可減少因H2S揮發(fā)導(dǎo)致的影響。

本文采用了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測(cè)了大鼠腦組織中H2S。檢測(cè)結(jié)果表明健康SD大鼠腦皮質(zhì)組織中基礎(chǔ)H2S濃度約為(11.84±0.38) μmol·L-1，明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的亞甲基藍(lán)法測(cè)定的大鼠腦內(nèi)H2S濃度在50～160 μmol·L-1范圍[17]。是否由于亞甲基藍(lán)法在665 nm處檢測(cè)H2S時(shí)，易受到其它物質(zhì)的干擾，造成檢測(cè)值偏高，而C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測(cè)H2S具有良好的選擇性，前處理時(shí)去除了大部分蛋白，更接近體內(nèi)H2S真實(shí)濃度，當(dāng)然這還有待于今后進(jìn)一步的研究證實(shí)。同時(shí)，本文也觀察到靜脈注射NaHS后，大鼠腦皮質(zhì)組織中的H2S濃度呈劑量依賴性增加，這不僅驗(yàn)證了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法可以檢測(cè)腦組織中H2S，也表明外源性H2S可透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織。

綜上所述，本文成功建立了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測(cè)腦組織中H2S的方法，為腦組織中H2S的定量測(cè)定提供了一個(gè)可靠、有效的方法，并證明外源性H2S可透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織。