高原低氧對小鼠體內(nèi)丙戊酸鈉腦血分布的影響

胡 琳，趙安鵬,秦寧寧，馬江紅，申亦可，謝 華, 李文斌，王 榮,

(1. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科, 甘肅 蘭州 730050)

丙戊酸鈉是目前癲癇治療的一線推薦藥物，對各種類型癲癇有效，應(yīng)用廣泛，但是其治療窗窄，近期發(fā)現(xiàn)對血液系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一些不良反應(yīng)，例如高血氨癥和認(rèn)知功能障礙等[1]。臨床上通過治療藥物監(jiān)測尋找最佳用藥劑量，使患者的血藥濃度處于治療窗內(nèi)，從而間接控制藥物入靶器官即大腦的藥物濃度。中樞神經(jīng)藥物需通過血腦屏障進(jìn)入腦組織發(fā)揮藥效。狹義的血腦屏障 (blood brain barrier，BBB)[2]是指將中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周循環(huán)系統(tǒng)分開的由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、基底膜以及與附在內(nèi)皮細(xì)胞的周細(xì)胞和神經(jīng)元組成多細(xì)胞血管結(jié)構(gòu)，它通過調(diào)節(jié)外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的分子交換來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)血腦屏障對藥物的通透性發(fā)生改變時(shí)，治療藥物監(jiān)測獲得的血藥濃度則可能無法正確反映腦內(nèi)藥物濃度，對藥物治療的安全性、有效性帶來潛在的危害[3]。Dagan等[4]研究表明，簡單地使用血藥濃度作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中藥物濃度的替代標(biāo)志物可能會(huì)導(dǎo)致劑量不足。藥物透過血腦屏障的程度除取決于藥物自身的性質(zhì)外，血腦屏障完整程度及血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量與功能也是重要的因素[5]。課題組前期研究表明，高原低氧會(huì)不同程度改變血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[6-7]。丙戊酸鈉作為BBB中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外排泵P-gp的底物[8]，在高原低氧環(huán)境下，其血腦透過率是否會(huì)發(fā)生改變？本研究對高原低氧環(huán)境下丙戊酸鈉的血藥濃度及入腦丙藥物濃度進(jìn)行分析，并研究缺氧對血腦屏障上藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp表達(dá)的影響，旨為高原丙戊酸鈉合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑丙戊酸鈉對照品(批號(hào)100963-202004)、替米沙坦對照品(批號(hào)100629-200401)和丙戊酸鈉(批號(hào)Y18J7C16394)分別購自中國食品藥品檢定研究院和上海源葉生物技術(shù)有限公司；色譜純乙腈(批號(hào)JA107230)購自德國MERCK公司；乙酸銨(批號(hào)H2110077)、伊文斯藍(lán)(批號(hào)1922129)購自aladdin；葡聚糖(70 ku，批號(hào)C1755925)購自Merck millipore；細(xì)胞濾網(wǎng)(40 μm、100 μm)購自biosharp；山羊抗兔IgG-HRP二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；Anti-P Glycoprotein antibody (ab170904)和Anti-Atp1a1 antibody (ab76020) 購自美國Abcam公司。

1.2 主要儀器UFLC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；API3200三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Spectra Max i3酶標(biāo)儀(美國Molecula公司)；蛋白免疫印跡電泳儀(美國Bio-Rad)；Chemi DOCTMMP Imaging System(美國BIO-RAD公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂昆明小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘭州聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)指導(dǎo)原則和規(guī)定進(jìn)行，審批編號(hào)：2021KYLL190。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及急進(jìn)方式將♂昆明小鼠隨機(jī)分為對照組(甘肅蘭州，海拔1 500 m)和高原低氧組(青海玉樹巴塘，海拔4 010 m)。對照組小鼠(分為P1、 P2、P3、P4，共4組)在蘭州禁食12 h后開始實(shí)驗(yàn)；高原低氧組小鼠(分為H1、H2、H3、H4，共4組)航空及公路托運(yùn)至青海玉樹巴塘，禁食12 h后開始實(shí)驗(yàn)。其中P1、H1組用于灌胃給藥，P2、H2組用于靜脈注射給藥，P3、H3組提取血腦屏障，P4組、H4組用于評價(jià)血腦屏障通透性。

2.2 樣品收集P1組和H1組小鼠(每組36只)灌胃給予 (i.g.) 136.5 mg·kg-1的丙戊酸鈉(小鼠給藥劑量由人體給藥劑量15 mg·kg-1通過體表面積換算獲得)，并于給藥第5、10、30、60、120、240 min時(shí)分別取6只小鼠取血，兩組共72只；P2組和H2組小鼠(每組60只)尾靜脈注射 (i.v.) 相同劑量的丙戊酸鈉，給藥后第2、5、30、60、120、240 min時(shí)分別取10只小鼠取血，兩組共120只，1 000×g離心5 min，取上層血漿-80 ℃保存。上述小鼠取血后立即處死，取大腦并用生理鹽水洗凈，-80℃保存。

2.3 色譜質(zhì)譜條件Gemini C18 (3.0 mm×75 mm, 3.0 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨溶液 (85 ∶15,V/V)；柱溫：25 ℃，流速：0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量：2 μL，分析時(shí)間為3 min。在ESI源負(fù)離子電離方式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM)有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓 (IS)為-4 500 V，霧化溫度 (TEM)為400 ℃，丙戊酸鈉和替米沙坦碰撞誘導(dǎo)解離電壓 (DP)分別為-30 psi、-15 psi，碰撞能量 (CE)為-5 psi、-19 psi。丙戊酸鈉、替米沙坦檢測離子分別為m/z 142.6→142.6、m/z 513.2→469.2。

2.4 生物樣品處理方法準(zhǔn)確吸取血漿樣品10 μL置于0.5 mL的EP管中，加入40 μL大鼠空白血漿，再加入200 μL的5 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩30 s，4 500×g離心10 min后取上清于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量2 μL。取備用腦組織，稱取0.1 g腦皮層于2 mL的EP管中，加1.0 mL生理鹽水勻漿，取25 μL勻漿液再加入175 μL的5 mg·L-1內(nèi)標(biāo)對照品工作溶液，渦旋震蕩30 s，4 500×g離心10 min后取上清液進(jìn)樣。

2.5 血腦屏障提取P3組和H3組(每組10只)小鼠處死后，立即取出大腦。大腦在冰冷的Hank’s溶液中剝?nèi)ボ浤X膜，再去除大血管和髓質(zhì)。剩余組織在Hank’s溶液使用玻璃勻漿器上下勻漿6次，勻漿液于1 000×g離心10 min。沉淀重懸于15 mL 18%葡聚糖中，然后在4 500×g離心15 min。沉淀重懸于Hank’s溶液，懸浮液先后用100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)和40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾。隨后用含有2%蛋白酶抑制劑的Hank’s溶液收集濾網(wǎng)上的腦微血管，4 500×g離心15 min后收集的沉淀即為腦微血管[9]。采用膜提取試劑盒提取腦微血管的膜蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。

2.6 血腦屏障通透性評價(jià)P4組和H4組小鼠(每組6只)尾靜脈注射 (i.v.)2%伊文斯藍(lán)溶液 (2 mL·kg-1),循環(huán)45 min后迅速取出全腦用濾紙吸凈。右半球腦組織在3 mL甲酰胺中剪碎后，60 ℃水浴孵育24 h，4 500×g離心5 min。在610 nm處，測量伊文思藍(lán)含量。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，結(jié)果表示為(μg伊文思藍(lán)染色)/(g組織)。

2.7 P-gp蛋白的定量通過7%SDS-PAGE分離蛋白樣品，并在恒定電壓80 V下轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗anti-P-gp antibody, anti-ATP1a1 antibody 4 ℃過夜孵育。隨后用TBST洗4次后，室溫孵育二抗后，PVDF膜用TBST洗4次后，進(jìn)行曝光。

2.8 數(shù)據(jù)處理腦/血藥物濃度比值=腦組織藥物濃度(μg·g-1) /血漿藥物濃度(mg·L-1)，即K(brain/plasma)=C (brain)/C (plasma)[10]；曝光圖片通過ImageJ軟件分析目的蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 方法驗(yàn)證

3.1.1專屬性 取空白血漿、空白腦組織、空白血漿加丙戊酸鈉、空白腦組織加丙戊酸鈉及給藥后的小鼠生物樣品，按照“1.4.2”方法處理進(jìn)樣,丙戊酸及內(nèi)標(biāo)替米沙坦的典型色譜圖見Fig 1，從圖可知該方法對丙戊酸鈉和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的專屬性良好，腦組織及血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾色譜分析，滿足定量要求。

Fig 1 Chromatograms of sodium valproate in biological samplesA，B: Blank plasma and blank brain, C，D: Blank plasma and blank brain spiked with standard sodium valproate, E-F: Sample of plasma and brain, Blue: Sodium valproate; Red: IS.

3.1.2線性范圍 丙戊酸在血漿和腦組織中線性范圍為0.05～100 mg·L-1，得到的線性回歸方程為:Y=0.001 51X+4.49(r=0.997 4)；Y=0.013 1X+0.598 6(r=0.999 6)，結(jié)果表明待測物在設(shè)定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

3.1.3精密度與準(zhǔn)確度 結(jié)果見Tab 1，丙戊酸鈉的日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度均滿足生物樣品測定要求。

Tab 1 Accuracy and precision of sodium

3.1.4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 丙戊酸鈉滿足定量要求，并且不存在明顯的生物樣品基質(zhì)效應(yīng)。

3.1.5穩(wěn)定性 丙戊酸鈉生物樣品在4 ℃保存24 h、3次反復(fù)凍融、-80 ℃保存一個(gè)月的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：在不同條件處理后，丙戊酸鈉生物樣品中濃度變化≤8.87%，表明具有良好的穩(wěn)定性。

3.2 生物樣品中藥物濃度的測定結(jié)果

3.2.1灌胃給藥的樣品藥物濃度 小鼠灌胃給藥丙戊酸鈉后，第5、10、30、60、120、240 min時(shí)血漿及腦組織中丙戊酸鈉分布見Fig 2。與對照組相比，給藥第30、60 min時(shí)高原組血藥濃度分別降低了35.77%、33.7%；高原組腦組織中藥物濃度高于對照組，其中給藥第60、120 min時(shí)高原腦組織藥物濃度分別升高了148.3%、172.0%；高原組腦/血藥物濃度比值在第10、30、60、120 min時(shí)分別增加44.0%、57.9%、176.8%、184.5%。

Fig 2 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice by intragastric administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/blood ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P1

3.2.2尾靜脈注射給藥的樣品藥物濃度 小鼠尾靜脈注射丙戊酸鈉第2、5、30、60、120、240 min時(shí)，血漿及腦組織中丙戊酸鈉藥物濃度見下Fig 3。由圖可知，與對照組相比，當(dāng)血藥濃度值相差不大時(shí)，高原組腦皮層中藥物濃度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對照組，且在第60 min時(shí)濃度增大27.4%，在第120 min時(shí)增大62.4%，在第240 min時(shí)增大45.8%。與對照組相比，高原組腦/血藥物濃度比值在第60、120、240 min時(shí)分別增加了33.9%、50.6%、125.6%。

Fig 3 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice injected intravenously administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/plasma ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P2

3.3 血腦屏障完整性評價(jià)對照組與高原組小鼠腦組織中伊文斯藍(lán)含量分別 (3.65±0.88) μg·g-1和 (3.67±0.76) μg·g-1，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明血腦屏障的完整性無明顯改變。

3.4 高原低氧對小鼠血腦屏障中P-gp表達(dá)的影響通過Western blot對腦微血管段中ABC族藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp進(jìn)行定量，在分子量為170 ku處檢測到特異性條帶。如Fig 4，與對照組相比，高原組P-gp蛋白相對表達(dá)量明顯下降了58.5% (P<0.05)。

Fig 4 Influence of altitude hypoxia environment (4010 m ) on P-gp protein expression level in blood brain barrier *P<0.05 vs P3

4 討論

癲癇患者不能被徹底治愈，需終身用藥。研究發(fā)現(xiàn)長期或高劑量服用丙戊酸鈉的患者會(huì)發(fā)生一系列不良反應(yīng)，例如神經(jīng)毒性[1]。高原低氧環(huán)境會(huì)不同程度改變血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，所以研究高原低氧對丙戊酸鈉入腦的影響十分必要。本研究通過灌胃和注射兩種給藥方式研究高原低氧對丙戊酸鈉的血腦屏障透過率的影響。結(jié)果表明，丙戊酸在高原組的血腦屏障透過率均高于對照組。除藥物自身性質(zhì)外，血腦屏障完整程度及血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量與功能也是影響藥物血腦屏障透過率的重要因素。

在研究高原低氧對丙戊酸鈉腦組織分布影響之前，我們首先使用伊文斯藍(lán)對血腦屏障進(jìn)行完整性評價(jià)。伊文斯藍(lán)可與白蛋白(血漿中分子量最小的蛋白之一)形成復(fù)合體，若血腦屏障完整性受到破壞，復(fù)合體會(huì)遷移到腦組織中。根據(jù)腦組織中伊文斯藍(lán)的含量可判斷血腦屏障的完整性。伊文斯藍(lán)結(jié)果表明，高原組與對照組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量無顯著性差異，表明本研究所采用的高原低氧條件對小鼠的血腦屏障完整性無明顯影響，這與前期課題組結(jié)果相同[11]。許多耐藥性癲癇患者對多種抗癲癇藥表現(xiàn)出耐藥性，這些患者血藥濃度在有效范圍值內(nèi)時(shí)，卻沒有達(dá)到抗癲癇效果[12]，研究發(fā)現(xiàn)這可能是由于腦區(qū)域中P-gp和其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)體高表達(dá)的原因。P-糖蛋白 (P-gp)是一種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在小鼠腦微血管管腔表面表達(dá)，其可將進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞的部分底物藥物再次排向血液(即管腔側(cè))，從而減少藥物向腦組織的分布，研究表明減少BBB處P-gp的表達(dá)或抑制其功能會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)藥物濃度增加[13]。大多數(shù)抗癲癇藥是P-gp的底物。通過對所提取的小鼠腦微血管的P-gp進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，高原低氧環(huán)境下小鼠腦微血管的P-gp表達(dá)量下降，這可能是高原組丙戊酸鈉腦血透過率高于對照組的原因。因?yàn)镻-gp是外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其低表達(dá)量可能會(huì)使腦內(nèi)丙戊酸鈉外排減少。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)高原低氧環(huán)境增加了丙戊酸在小鼠血腦屏障上的透過程度，從而改變了丙戊酸在小鼠體內(nèi)的腦血分布，這可能與高原低氧環(huán)境下調(diào)了小鼠腦微血管上P-gp的表達(dá)量有關(guān)，這為高原癲癇患者合理用藥提供依據(jù)。