基于信息熵賦權(quán)法的正交試驗(yàn)優(yōu)選細(xì)辛-干姜藥對(duì)水提取工藝*

陳 明，莊星星，苗仁華，倪受東

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院，安徽 合肥 238000）

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoidesFr. Schmidt var. Mandshuricum（Maxim.）Kitag.，漢城細(xì)辛Asarum sieboldiiMiq.var.seoulense或華細(xì)辛Asarum SieboldiiMiq. 的干燥根和根莖，首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解表散寒止痛、通鼻竅、溫肺化飲功效［1］。細(xì)辛中化學(xué)成分豐富，其中木脂素類、黃酮類、甾體類、多糖類、揮發(fā)油（萜類、芳香族類、脂肪族類）等為其主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，細(xì)辛除了鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、平喘等藥理學(xué)活性外，還有抗病原微生物、鎮(zhèn)靜、抗氧化等作用［2］。干姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖，性熱、味辛，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲功效。干姜中化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油和姜酚類成分（姜酚和姜酮）兩大類［3］，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、改善心血管功能等藥理學(xué)作用［4］。細(xì)辛和干姜均具有溫肺化飲功效，兩藥配伍多用于治療肺寒之諸喘證。細(xì)辛-干姜藥對(duì)臨床主治病癥多，其中以咳喘、痰飲、風(fēng)寒感冒等呼吸系統(tǒng)疾病最多見［5-6］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)辛、干姜兩藥配伍可顯著降低寒飲蘊(yùn)肺證模型鼠血清中炎性因子（腫瘤壞死因子- α 和白細(xì)胞介素8）水平，減輕氣道炎癥，改善肺功能，延緩慢性阻塞性肺疾病發(fā)展，其藥效優(yōu)于單味中藥［7］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，細(xì)辛、干姜兩藥配伍具有協(xié)同作用及發(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)［8］。本課題組參考文獻(xiàn)［9 - 10］，根據(jù)傳統(tǒng)方劑最常見的細(xì)辛、干姜的1∶1（m/m）配伍比例［11］，利用信息熵賦權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)，以干姜中的重要活性成分6-姜酚和6-姜烯酚，細(xì)辛中的重要活性成分芝麻脂素和細(xì)辛脂素的含量，以及干浸膏得率為指標(biāo)［12-13］，優(yōu)選該藥對(duì)的最佳水提取工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有四元泵、二極管陣列檢測器、OpenLAB 工作站；BT25S 型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；KMD-500型調(diào)溫電熱套（金壇市鴻科儀器廠）；RE - 52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1204B型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司，精度為萬分之一）；TGL16E 型高速離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；JK100B 型超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；DZF6020 型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥

細(xì)辛脂素對(duì)照品（批號(hào)為DC - 19080704，純度99.70%），芝麻脂素對(duì)照品（批號(hào)為DC - 19111607，純度99.75%），6 - 姜酚對(duì)照品（批號(hào)為DC - 19040810，純度99.69%），6 - 姜烯酚對(duì)照品（批號(hào)為DC -19061204，純度99.70%），均購自南京滴純生物科技有限公司，規(guī)格均為每支20 mg；甲醇（批號(hào)為20180302），乙腈（批號(hào)為20171210），均為色譜純，購自天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；超純水（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院藥劑科）；細(xì)辛中藥飲片（產(chǎn)地遼寧，批號(hào)為17840301），干姜中藥飲片（產(chǎn)地貴州，批號(hào)為1802038），購自亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倪受東主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）- 水（B），梯度洗脫（0～15 min 時(shí)25%A，15～30 min 時(shí)25%A～50%A，30～55 min 時(shí)50%A，55～56 min 時(shí)50%A～25%A，56～60 min 時(shí)25%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：40 μL。

2.1.2 溶液制備

稱取細(xì)辛、干姜藥材各12.0 g，參考文獻(xiàn)［14- 15］方法提取藥材，所得提取液減壓濃縮，定容至50.0 mL容量瓶中；精密吸取濃縮液10.0 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?5%甲醇溶解，0.22 μm 微孔濾膜濾過，轉(zhuǎn)移至10.0 mL 容量瓶中，超聲（功率為100 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻后定容，即得供試品溶液（編號(hào)為1 - 9 號(hào)）。取6 - 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6 - 姜烯酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚對(duì)照品溶液。精密吸取細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液200 μL、芝麻脂素對(duì)照品溶液100 μL、6 - 姜酚對(duì)照品溶液200 μL 和6 - 姜烯酚對(duì)照品溶液200 μL，置同一100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成細(xì)辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚質(zhì)量濃度分別為2.00，1.00，2.00，2.00 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果供試品溶液和混合對(duì)照品溶液中6- 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素、6 - 姜烯酚分別在保留時(shí)間25.10，29.89，31.03，32.45 min 附近有色譜峰出現(xiàn)。供試品溶液色譜中有與混合對(duì)照品溶液色譜對(duì)應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋0，2，4，8，16，32 倍，制成系列混合對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear ralation test（n=6）

1.6-姜酚 2. 芝麻脂素 3. 細(xì)辛脂素 4.6-姜烯酚A. 混合對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.6-Gingerol 2.Sesamin 3.Asarinin 4.6-Shogaol A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗(yàn)：取8 號(hào)供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6-姜烯酚含量的RSD分別為0.18%，0.39%，0.09%，0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取細(xì)辛、干姜藥材各12.0 g，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果6 - 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6 - 姜烯酚含量的RSD分別為1.54%，1.86%，1.37%，1.93%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取8 號(hào)供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，16，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果6- 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素和6 - 姜烯酚含量的RSD分別為1.54%，1.64%，1.37%，1.75%（n= 7），表明供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 干浸膏得率測定

取正交試驗(yàn)后的濃縮液（編號(hào)為1-9 號(hào)），分別精密量取1 - 9 號(hào)濃縮液各25 mL，置對(duì)應(yīng)干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，至干燥器中冷卻，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干浸膏得率。

2.3 水提取工藝優(yōu)選

采用信息熵賦權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選水提取工藝。以浸泡時(shí)間（因素A）、加水量（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）為考察因素，以6-姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素、6 - 姜烯酚含量及干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)［14-15］。正交試驗(yàn)因素與水平見表2，L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

采用信息熵賦權(quán)法對(duì)6 - 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素、6 - 姜烯酚含量及干浸膏得率進(jìn)行處理與分析，計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，得到綜合評(píng)分計(jì)算公式。

可見，6 - 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素、6 - 姜烯酚、干浸膏得率指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為0.153 7，0.156 2，0.166 2，0.254 4，0.269 5。將概率矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，計(jì)算綜合評(píng)分（M），M=Xi6-姜酚含量/Xmax6-姜酚含量×0.153 7 +Xi芝麻脂素含量/Xmax芝麻脂素含量× 0.156 2 +Xi細(xì)辛脂素含量/Xmax細(xì)辛脂素含量× 0.166 2 +Xi6-姜烯酚含量/Xmax6-姜烯酚含量×0.254 4+Xi干浸膏得率/Xmax干浸膏得率×0.269 5。以此進(jìn)行方差分析，以確定最優(yōu)試驗(yàn)方案。結(jié)果見表3。

由極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)綜合指標(biāo)的影響主次順序?yàn)镈 ＞C ＞A ＞B，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞加水量。由方差分析結(jié)果可知，因素A、因素C、因素D 對(duì)提取結(jié)果有顯著影響，因素B 影響不顯著。綜合考慮，確定最優(yōu)提取工藝為A3B1C3D3，即加6 倍量水，浸泡1.0 h，提取3次，每次2.0 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取細(xì)辛、干姜各12.0 g，按2.3 項(xiàng)下優(yōu)選的最佳水提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。測定各指標(biāo)，并計(jì)算綜合評(píng)分。由表5可知，該水提取工藝穩(wěn)定、可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the validation test

3 討論

多指標(biāo)評(píng)價(jià)權(quán)重系數(shù)的確定是中藥提取工藝優(yōu)化過程中的關(guān)鍵，直接影響試驗(yàn)結(jié)果。目前，研究者根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)主觀確定權(quán)重系數(shù)的主觀賦權(quán)法仍是主流，但缺乏科學(xué)依據(jù)。利用信息熵原理對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)，權(quán)重?cái)?shù)據(jù)完全來自對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的數(shù)理分析，可清晰地反映指標(biāo)成分在不同提取條件下變化的客觀規(guī)律，避免確定權(quán)重系數(shù)的主觀和局限。本研究中采用信息熵賦權(quán)法計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，所有數(shù)據(jù)均根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)原理通過統(tǒng)一公式計(jì)算得到，減少了研究者主觀因素對(duì)結(jié)果的影響［18-19］，提高了試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。確定6 - 姜酚、芝麻脂素、細(xì)辛脂素、6- 姜烯酚含量及干浸膏得率指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為0.153 7，0.156 2，0.166 2，0.254 4，0.269 5，權(quán)重系數(shù)根據(jù)各考察指標(biāo)在9組正交試驗(yàn)中的變化差異而定，綜合考慮各指標(biāo)對(duì)9組數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)率，試驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)、可信。

分別參考2020年版《中國藥典（一部）》中細(xì)辛和干姜2 味中藥材含量測定中的色譜條件，但該色譜條件中的流動(dòng)相和檢測波長在試驗(yàn)條件下無法最大限度地將藥對(duì)中的成分進(jìn)行分離，通過全波段掃描確定了于205 nm 波長下有最大紫外吸收；在對(duì)比不同流動(dòng)相比例下目標(biāo)成分的分離度后，最終確定了2.1.1項(xiàng)下的流動(dòng)相梯度洗脫程序［20］。

綜上所述，信息熵賦權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選出細(xì)辛- 干姜藥對(duì)的最佳水提取工藝為加6 倍量水，浸泡1.0 h，提取3 次，每次2.0 h，該工藝穩(wěn)定、可行，可為該藥對(duì)的后續(xù)研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。