野生型p27 和核定位信號缺失型p27真核表達載體的構(gòu)建及表達

焦鑫艷 ，張 英 ，盛 秋 ，張 妙 ，楊澤健 ，高小倩 ，趙 謙 ，王 博 ，劉培軍

（1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710061；2. 陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點實驗室，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061；4. 西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院，陜西西安 710072；5. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，陜西西安 710061）

細(xì)胞內(nèi)的核輸入和核輸出是一個多種蛋白質(zhì)和復(fù)合物在核膜上高度協(xié)調(diào)工作的生物學(xué)過程，維持著細(xì)胞生長和死亡的平衡，對保證細(xì)胞正常的功能和新陳代謝十分必要。核輸入和核輸出的紊亂則引起如p27、p21、FOXO、p53 和 Rb 等腫瘤抑制因子的定位異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。其中，p27 的編碼基因為CDKN1B，其在細(xì)胞中廣泛表達，并高度保守，很少發(fā)生突變或者缺失。p27 蛋白作為周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族的重要成員，可通過其保守的N 端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并抑制細(xì)胞質(zhì)中的周期蛋白和CDK 復(fù)合體的激酶活性，負(fù)調(diào)控細(xì)胞G1期向S 期轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞周期進程，在細(xì)胞增殖中具有重要作用[2]。文獻報道，細(xì)胞內(nèi)總p27 表達變化影響細(xì)胞增殖，而p27 的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)定位是影響細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素[3]，胞核p27 蛋白的聚集表現(xiàn)出抗增殖活性[4]。在正常細(xì)胞中，p27 大部分位于細(xì)胞核；但在許多腫瘤細(xì)胞中，p27 定位紊亂，大部分定位于細(xì)胞質(zhì)。這可能是由于p27 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中具有不同作用，而在腫瘤的發(fā)生過程中，一般伴隨著p27 的核漿移位。因此，進一步了解p27 核漿定位的變化對深入研究腫瘤的惡性發(fā)展很有必要。

本研究擬從人MCF7 細(xì)胞的總RNA 中特異性擴增出野生型p27 蛋白（wild-type p27，p27WT）的CDs區(qū)序列，再通過重疊PCR 的方法擴增出核定位信號缺失型 p27 蛋白（lacking nuclear localization signal p27，p27△NLS）序列，將其分別連接至真核表達載體pCMV-Blank。經(jīng)Sanger 測序鑒定后，電穿孔法轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，驗證 p27WT 和 p27△NLS 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的過表達水平，為今后探討p27核漿定位機制以及腫瘤惡性生物學(xué)行為研究提供細(xì)胞基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基（美國 Corning 公司），胎牛血清（美國 Gibco 公司），RNA FAST200 試劑盒（上海Fastagen 公司），限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ（英國 NEB 公司），反轉(zhuǎn)錄 cDNA 試劑盒、T4 DNA 連接酶（美國 Thermo 公司），PrimeSTAR 高保真 PCR酶（日本TaKaRa 公司），DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），PVDF 膜、免疫印跡發(fā)光液（美國Millipore 公司），兔抗人p27 抗體（美國Santa Cruz 公司），GAPDH 抗體、兔抗人Lamin B1 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），山羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞核漿蛋白分離試劑盒（陜西先鋒生物科技有限公司）。相關(guān)PCR 引物由西安擎科生物公司合成。

1.2 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞系

真核表達載體pCMV-Blank（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；宿主菌E.coliDH5α（北京天根生化科技有限公司）；人胚腎細(xì)胞HEK293T 為本實驗室保存細(xì)胞，使用含50 mL/L 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，并置于37 ℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)。

1.3 獲取p27WT 和p27△NLS 編碼區(qū)片段

根據(jù) GenBank 中 人CDKN1B（NM_004064.5）基因的CDs 序列，以及在UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uniprot/）查詢p27 蛋白的核定位信號序列區(qū)域。隨后，應(yīng)用軟件Oligo 7 設(shè)計針對p27全長編碼區(qū)的特異性PCR 引物，并在上游引物加入酶切位點BamHⅠ和保護堿基，p27WT-F：5′-CGCGGATCCATGTCAAACGTGCGAGTGTCT-3′，在下游引物加入酶切位點EcoR Ⅰ和保護堿基，p27WT-R：5′-CGGAATTCTTACGTTTGACGTCTTCTGAGGCC-3′；同時針對核定位信號缺失設(shè) 計 重 疊 PCR 引 物 ，上 游 引 物 p27 △ NLS-F：5′-GAGCAATGCGCAGGAATAAGGACAGAAGAAAATGTTTCAGACGGT-3′，下 游 引 物 p27 △NLS-R： 5′-ACCGTCTGAAACATTTTCTTCTGTCCTTATTCCTGCGCATTGCTC-3′。 收 集MCF7 細(xì)胞，依照RNA FAST200 試劑盒說明書，提取細(xì)胞總RNA；隨后依照反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA 為模板，p27WT-F和 p27WT-R 為引物，經(jīng) PCR 獲取 p27WT 全長編碼區(qū)的序列，并對PCR 產(chǎn)物進行切膠純化回收。

再以該膠回收純化產(chǎn)物為模板，以p27WT-F 和p27△NLS-R 為引物，經(jīng) PCR 獲取 p27-FR1 序列；以p27△NLS-F 和 p27WT-R 為引物，經(jīng) PCR 獲取 p27-F1R 序列，分別進行切膠純化回收。

最后以p27WT-F 和p27WT-R 為引物，以p27-FR1 和 p27-F1R 序列為模板，進行重疊 PCR 擴增，獲取p27△NLS 片段的序列，并進行切膠純化回收。PCR 反 應(yīng) 體 系 ：cDNA 模 板 1 μL，10 μmol/L 上 游和下游引物各 1 μL，5×PCR Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，高 保 真 PCR 酶 1 μL，補 足 ddH2O 至 50 μL。PCR 反 應(yīng) 條 件 ：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，39 個循環(huán)。該 PCR 產(chǎn)物通過 12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4 構(gòu)建p27WT 和p27△NLS 真核表達載體

將 p27WT 和 p27△NLS 的 PCR 產(chǎn)物分別進行切膠回收純化，隨后與真核表達載體pCMV-Blank分別進行BamHⅠ和EcoRⅠ的37 ℃雙酶切反應(yīng)2 h。將雙酶切產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳和切膠回收純化，并檢測濃度。

依照基因片段與載體摩爾比3∶1 的比例，使用T4 DNA 連接酶分別將 p27WT 和 p27△NLS 與真核表達載體pCMV-Blank 于16 ℃進行連接過夜。再將其分別轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂在含有卡那霉素的LB 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取數(shù)個單克隆菌落，接種在含有卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床，220 r/min 振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至渾濁后，取 1 μL 菌液，用無菌水稀釋 100 倍，100 ℃煮沸10 min 后，取 1 μL 作為模板，進行菌液 PCR，鑒定p27WT 和p27△NLS 片段是否成功插入真核表達載體中。將菌液PCR 鑒定陽性的單克隆菌液提取質(zhì)粒后，進行雙酶切鑒定。最后將雙酶切鑒定陽性的克隆質(zhì)粒送西安擎科生物公司進行Sanger 測序鑒定。將序列比對正確的陽性克隆載體分別命名為pCMV-p27WT 和 pCMV-p27△NLS。

1.5 電穿孔法轉(zhuǎn)染pCMV-p27WT 和pCMV-p27△NLS 質(zhì)粒

依照無內(nèi)毒素的質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書，提取無內(nèi)毒素的質(zhì)粒pCMV-Blank、pCMV-p27WT 和pCMV-p27 △NLS。 收集處于對數(shù)生長期的HEK293T 細(xì)胞，依照轉(zhuǎn)染說明書，將適量質(zhì)粒和細(xì)胞混勻后，加入電極杯。設(shè)置程序：脈沖電壓120 V，脈沖時間10 ms，脈沖時間間隔10 ms。分別將pCMVBlank、pCMV-p27WT 和 pCMV-p27△NLS 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，并置于 37 ℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)，24 h 后更換新鮮的培養(yǎng)基。

1.6 檢 測 pCMV-p27WT 和 pCMV-p27△ NLS 質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達

經(jīng)電穿孔法將無內(nèi)毒素質(zhì)粒pCMV-Bank、pCMV-p27WT 和 pCMV-p27△NLS 分 別 轉(zhuǎn) 染 HEK293T 細(xì)胞 。 48 h 后 ，經(jīng) PBS 清 洗 ，無 EDTA 的 胰 酶 消 化 ，PBS 清洗并收集細(xì)胞。依照細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離試劑盒說明書，分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白。經(jīng)Bradford法進行蛋白定量，按照每孔100 μg 的上樣量進行100 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，50 g/L 脫脂奶 粉 封 閉 ，一 抗（p27，1∶500；LaminB1，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000）孵育，TBST 洗膜，二抗（山羊抗兔，1∶5 000）孵育，TBST 洗膜等步驟后，進行化學(xué)發(fā)光，并使用成像系統(tǒng)進行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 p27WT 和p27△NLS 蛋白結(jié)構(gòu)域的分析

通過UniProt 數(shù)據(jù)庫的在線分析，可知人野生型p27 蛋白包括 N 端的 Cyclin 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（28-51aa）和CDK 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（51-91aa），以及 C 端的 NLS 結(jié)構(gòu)域（153-169aa）等，均較為保守（圖1）。Cyclin 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Cyclin 亞基結(jié)合，CDK 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CDK 亞基如CDK2 結(jié)合，均為調(diào)控細(xì)胞周期抑制的結(jié)構(gòu)域；NLS 結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)引導(dǎo)p27 蛋白入核。所構(gòu)建包含p27WT 全長片段和p27△NLS 片段的真核表達載體，后者不包含NLS 結(jié)構(gòu)域部分，可阻斷p27 蛋白入核，使p27 蛋白幾乎全部表達在細(xì)胞質(zhì)中。

圖1 人p27WT 全長編碼區(qū)和p27△NLS 編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic diagram of human p27WT and p27△NLS domains

2.2 人p27WT 和p27△NLS 編碼區(qū)序列的克隆

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，p27WT 全長編碼區(qū)的PCR 產(chǎn)物為600 bp 左右基因條帶（圖2A），與預(yù)期的p27 全長編碼區(qū)序列594 bp 大小相一致；隨后以該PCR 純化產(chǎn)物為模板，獲取 489 bp 的 p27-FR1 序列（圖2B）和119 bp 的p27-F1R 序列（圖2C）；最后進行重疊PCR擴增，獲取543 bp的p27△NLS序列（圖2D），與預(yù)期大小一致。

圖2 人p27WT 全長編碼區(qū)和p27△NLS 編碼區(qū)的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic diagram of PCR fragment of human p27WT and p27△NLS

2.3 真核表達載體pCMV-p27WT 和pCMV-p27△NLS 的鑒定

菌液PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，p27WT 的7 號和p27△NLS 的3 號為陽性克隆，PCR 產(chǎn)物電泳分別為594 bp 和543 bp，與理論大小相同（圖3A）。載體雙酶切鑒定的電泳結(jié)果顯示，分別獲得4 300 bp 和594 bp、4 300 bp 和 543 bp 的 基 因 條 帶 ，其 中 4 300 bp 為 線 性載體pCMV-Bank 的產(chǎn)物大小，另一個分別為插入的p27WT 和 p27△NLS 序列產(chǎn)物大小（圖 3B）。測序后，在NCBI 中序列比對結(jié)果顯示，載體pCMV-p27WT 中插入的人p27 全長編碼區(qū)序列完全正確；載體pCMV-p27△NLS 中插入的人p27 編碼區(qū)序列缺失核定位信號序列，故以上兩種質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒pCMV-p27WT 和pCMV-p27△NLS 的菌液PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果和雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification of recombinant plasmids pCMV-p27WT and pCMV-p27△NLS with bacterial PCR and double restriction enzyme digestion

2.4 p27WT 和 p27△NLS 的細(xì)胞表達情況

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，pCMV-p27WT轉(zhuǎn)染組中p27 蛋白在細(xì)胞核中顯著表達，而pCMV-p27△NLS 轉(zhuǎn)染組的p27 蛋白在細(xì)胞核中僅有微弱表達（圖4）。這提示構(gòu)建的真核表達載體pCMV-p27WT和pCMV-p27△NLS可以在細(xì)胞中成功表達目的基因p27WT及缺失核定位信號的p27△NLS。

圖4 HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核p27 蛋白的表達情況Fig.4 Detection of cytoplasmic and nuclear p27 protein expression after transfection with recombinant plasmids in HEK293T cells

3 討 論

在哺乳動物中，p27 作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)因子，參與增殖、分化、凋亡等決定細(xì)胞命運和組織生長的生物學(xué)過程。大量研究證實，許多腫瘤標(biāo)志物基因可通過p27 蛋白調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1,5-6]。在乳腺癌、大腸癌、卵巢癌和前列腺癌等腫瘤中，p27 蛋白表達較低，并且與患者較差的預(yù)后相關(guān)[2]。在腫瘤進程中，p27 主要通過磷酸化調(diào)控自身表達和胞質(zhì)定位。細(xì)胞核p27 蛋白表達降低可顯著促進細(xì)胞周期進程和細(xì)胞增殖[4,7-8]。臨床研究提示，p27 蛋白的細(xì)胞核表達是鼻咽癌患者有較好預(yù)后的有利因素[9]。核p27表達在腎細(xì)胞癌中經(jīng)常丟失，可作為不良預(yù)后的指示因子，有助于高危腎透明細(xì)胞癌患者的診斷[10]。因此，p27 蛋白的抑癌活性，很大部分依賴于細(xì)胞核的亞定位水平。

在很多類型的腫瘤中，不僅有細(xì)胞核p27 蛋白表達的降低或者丟失，同時也伴隨著細(xì)胞質(zhì)的移位。核輸出蛋白染色體區(qū)域維持蛋白CRM1 的下調(diào)通過改變p27 蛋白的亞細(xì)胞定位，促進p27 蛋白入核，減少細(xì)胞質(zhì)p27 蛋白表達，并且抑制p27 蛋白降解，減緩內(nèi)皮性卵巢癌發(fā)病進程[11]。臨床治療方面，p27 蛋白的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比率對早期乳腺癌患者輔助綜合化療的效果具有重要的參考意義[12]，細(xì)胞質(zhì)低p27 表達和細(xì)胞核高p27 表達共同預(yù)示著高級別的星形膠質(zhì)瘤患者中較好的預(yù)后情況[13]?？梢姡?xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的p27 蛋白通過協(xié)同作用，共同影響著腫瘤的發(fā)展和預(yù)后。

然而，在部分腫瘤中，細(xì)胞核p27 在細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，而細(xì)胞質(zhì)p27 在細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，p27的細(xì)胞質(zhì)定位能夠使該蛋白的抑癌功能失活。細(xì)胞質(zhì)p27 蛋白的減少顯著抑制腫瘤細(xì)胞運動、細(xì)胞存活和致癌進程[14-15]。細(xì)胞質(zhì)p27 蛋白與腫瘤患者較差的預(yù)后緊密相關(guān)[16-18]。而且，細(xì)胞質(zhì)p27 的表達能通過抑制細(xì)胞凋亡增強HER2 陽性乳腺癌細(xì)胞的拉帕替尼抗性[19]?？傊cp27 蛋白本身的抑癌作用相反，細(xì)胞質(zhì)p27 蛋白可能在細(xì)胞的存活、運動、侵襲和細(xì)胞間黏附等方面發(fā)揮著促癌作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCMV-p27WT 和 pCMV-p27 △ NLS，并 在 HEK293T 細(xì) 胞中成功表達。未來可通過改變工具細(xì)胞、正常細(xì)胞或是腫瘤細(xì)胞中p27 蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的表達分布，探討不同病理條件下p27 蛋白功能，為腫瘤惡性機制的深入研究提供了重要的實驗基礎(chǔ)。