北五味子根葉多糖對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用研究

SUHAYB Mahamed Farah，陳紅旭，苑麗葳，劉佳樂，孫靖輝，王春梅，張成義，陳建光，李 賀

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

睡眠是人類必不可少的一種生理現(xiàn)象，人們的睡眠時(shí)間約占生命活動(dòng)總時(shí)間的三分之一[1].研究[2]表明：高質(zhì)量的睡眠不僅能保護(hù)和恢復(fù)腦細(xì)胞的功能，還能夠增強(qiáng)自身免疫.目前，世界范圍內(nèi)約有27%的人群正在被失眠所困擾[3]，長期失眠不僅會(huì)影響人的工作效率，而且對(duì)身心健康不利[4].臨床上治療失眠的藥物以化學(xué)合成類為主，長期使用會(huì)產(chǎn)生明顯的依賴性、呼吸抑制等副作用[5].自古以來有大量的中藥材被認(rèn)為具有鎮(zhèn)靜催眠、養(yǎng)身安神的功效，并且毒副作用小，安全指數(shù)高，具有較好的研究和開發(fā)應(yīng)用前景[6].

五味子作為傳統(tǒng)的中藥材，在《神農(nóng)本草經(jīng)》等大量古籍中都有記載，其具有豐富的木脂素以及多糖成分[7].本團(tuán)隊(duì)近年的研究[8-12]表明：五味子的有效成分具有降血脂、抗疲勞、抗氧化、抗肝損傷、鎮(zhèn)靜催眠等功效.吉林省是五味子的重要產(chǎn)區(qū)，五味子的果實(shí)需求量較大，其根、葉在前期研究發(fā)現(xiàn)也含有多糖、木脂素等有效成分，因此，應(yīng)該對(duì)其非藥用部位展開深入研究并加以利用[13].本實(shí)驗(yàn)選用吉林省集安市優(yōu)質(zhì)北五味子，為有效開發(fā)利用資源，我們提取了五味子根及葉的多糖成分，觀察其對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用的影響，以期為五味子的全面開發(fā)及鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮藥物的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材 料

地西泮(山東信誼制藥有限公司)；羧甲基纖維素鈉、戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司)；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamate，Glu)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；北五味子根、葉粗多糖(北華大學(xué)五味子開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化工程研究中心提供).

1.2 動(dòng) 物

ICR小鼠(長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(吉)-2020-0001)，體質(zhì)量(20±2)g，雄性，分籠飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，室溫20～25 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 儀 器

ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀、PMT-100高架十字迷宮(成都泰盟科技有限公司)；手持組織勻漿機(jī)(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；大容量高速離心機(jī)(Eppendorf生命科學(xué)公司，德國)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將120只ICR小鼠隨機(jī)平均分組，分別為空白對(duì)照組(CON，蒸餾水灌胃)、根多糖組(SRP，含量23.6 mg/g，給藥劑量為152 mg/kg)、葉多糖組(SLP，含量19.7 mg/g，給藥劑量為189 mg/kg)、地西泮陽性對(duì)照組(DAP，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前以4 mg/kg灌胃).小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后灌胃1次/d.

2.2 SRP、SLP對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

每組取前10號(hào)小鼠于灌胃30～40 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠5 min內(nèi)站立以及活動(dòng)次數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后噴灑酒精除去氣味后方可進(jìn)行下一組實(shí)驗(yàn).

2.3 SRP、SLP對(duì)小鼠高架十字迷宮行為學(xué)的影響

選取進(jìn)行過自主活動(dòng)后的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn).將小鼠(灌胃30～40 min后)置于空曠區(qū)域中活動(dòng)5 min，再將小鼠置于迷宮中心，記錄小鼠進(jìn)入開臂和閉臂區(qū)域的次數(shù)(開臂次數(shù)/在臂次數(shù)比例(OE)，在臂次數(shù)=開臂次數(shù)+閉臂次數(shù))和時(shí)間(開臂滯留時(shí)間/在臂滯留時(shí)間比例(OT)，在臂時(shí)間=開臂滯留時(shí)間+閉臂滯留時(shí)間)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(5 min內(nèi)數(shù)據(jù)).在實(shí)驗(yàn)完成后需噴灑酒精以清除氣味.

2.4 SRP、SLP對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的影響

選取進(jìn)行過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的小鼠，腹腔注射閾下劑量的戊巴比妥鈉(37.5 mg/kg)，記錄翻正反射消失60 s以上的小鼠數(shù)量(30 min內(nèi))；每組10～20號(hào)小鼠在給藥40 min后，腹腔內(nèi)給予閾值劑量的戊巴比妥鈉(49.5 mg/kg).記錄睡眠時(shí)間和覺醒時(shí)間.

2.5 小鼠腦組織中GABA、Glu含量測(cè)定

在末次給藥40 min后，斷頸處死每組20～30號(hào)小鼠，置于裝滿冰塊的燒杯中迅速取下大腦，用4 ℃生理鹽水洗凈并擦干稱重，高速勻漿并分離上清(4倍加入生理鹽水，4 ℃，離心10 min，3 000 r/min)，實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 SRP、SLP對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

本研究結(jié)果顯示：與CON比較，SRP組及DAP組小鼠站立次數(shù)明顯減少(P<0.01)，SLP組小鼠站立次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SRP組與SLP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).SRP組、SLP組及DAP組小鼠活動(dòng)次數(shù)均明顯減少(P<0.01)，且SRP組與SLP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示SRP和SLP具有鎮(zhèn)靜作用.見圖1 a、b.

*.與CON組比較P<0.05；**.與CON組比較P<0.01；##.與SLP組比較P<0.01.圖1SRP、SLP對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響Fig.1Effect of SRP and SLP on autonomous activities of

3.2 SRP、SLP對(duì)小鼠高架十字迷宮行為學(xué)的影響

本研究結(jié)果顯示：與CON組比較，SRP組、SLP組及DAP組小鼠開臂次數(shù)/在臂次數(shù)比例(OE)均明顯升高(P<0.01)；SRP組、SLP組及DAP組小鼠開臂滯留時(shí)間/在臂滯留時(shí)間比例(OT)均明顯升高(P<0.01)，提示SRP、SLP可能具有抗焦慮作用.見圖2 a、b.

**.與CON組比較P<0.01.圖2SRP、SLP對(duì)高架十字迷宮小鼠的影響Fig.2Effect of SRP and SLP on elevated plus maze

3.3 SRP、SLP對(duì)戊巴比妥鈉致小鼠睡眠的影響

戊巴比妥鈉閾下劑量協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CON組、SRP組、SLP組、DAP組睡眠只數(shù)分別為1、6、2、10只.睡眠率分別為10%、60%、20%、100%.

戊巴比妥鈉閾劑量協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在睡眠潛伏期的比較中，與CON組比較，SRP組和DAP組小鼠睡眠潛伏期極顯著減少(P<0.01)，SRP組與SLP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見圖3 a.與空白對(duì)照組比較，SRP組、SLP組及DAP組小鼠睡眠時(shí)間均明顯增加(P<0.01)；與SLP組比較，SRP組睡眠時(shí)間均明顯增加(P<0.05，P<0.01)，提示SRP、SLP可能具有催眠功效.結(jié)果見圖3 b.

**.與CON組比較P<0.01；#.與SLP組比較P<0.05；##.與SLP組比較P<0.01.圖3SRP、SLP對(duì)閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期的影響Fig.3Effects of SRP and SLP on the sleep latency of mice induced by threshold-dose pentobarbital

3.4 SRP、SLP對(duì)小鼠腦組織中GABA、Glu含量的影響

在GABA的檢測(cè)中，SLP組與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SRP組與空白組、SLP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在Glu的檢測(cè)中，SRP組、SLP組與CON組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且SRP組與SLP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在GABA/Glu的影響研究中，SRP組、SLP組與CON組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，SRP組和SCP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).提示SRP、SLP均可能通過調(diào)控GABA、Glu的含量來達(dá)到鎮(zhèn)靜催眠效果的.見圖4 a、b、c.

*.與CON組比較P<0.05；**.與CON組比較P<0.01；##.與SLP組比較P<0.01.圖4SRP、SLP對(duì)小鼠腦組織中GABA、Glu含量的影響Fig.4Effects of SRP and SLP on the content of GABA and Glu in the brain tissue of

4 討 論

長期失眠會(huì)使人工作效率變低，身心健康受到影響.失眠一般分為原發(fā)性失眠和繼發(fā)性失眠兩種，原發(fā)性失眠是經(jīng)過多重篩查后，仍不能明確是何因素導(dǎo)致的失眠；繼發(fā)性失眠大多是由精神壓力、身體疾病、藥物等多種因素所導(dǎo)致的，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致無法對(duì)癥下藥.目前臨床上治療失眠以化學(xué)合成類藥物為主，巴比妥類雖具有良好的鎮(zhèn)靜催眠效果，但其長期使用有明顯的依賴性、呼吸抑制等副作用[14]；苯二氮卓類毒性較小，安全范圍大，長期使用會(huì)產(chǎn)生耐受性，停藥會(huì)有戒斷癥狀；非苯二氮卓類藥物雖優(yōu)于上一代，但也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)[15].自古以來，我國有大量的中藥材被認(rèn)為具有鎮(zhèn)靜催眠、養(yǎng)身安神的功效，毒副作用小，安全指數(shù)高，具有較好的研究和開發(fā)應(yīng)用前景[16].因此，尋找既安全又有效的鎮(zhèn)靜催眠藥物具有重要意義.

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)是測(cè)試小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，站立的次數(shù)和活動(dòng)的次數(shù)越高，則代表小鼠神經(jīng)系統(tǒng)興奮性越強(qiáng)[17].一般認(rèn)為小鼠開臂/在臂滯留時(shí)間百分率和開臂/在臂進(jìn)入次數(shù)百分率越小，焦慮程度越嚴(yán)重[18].戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)催眠藥物影響小鼠睡眠狀況的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，閾下劑量睡眠只數(shù)越多，睡眠潛伏期越短，閾劑量睡眠時(shí)間越長，則代表藥物的催眠效果越好[19].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SRP、SLP具有一定的鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用.

在本課題組前期研究[12]中發(fā)現(xiàn)，五味子果木脂素發(fā)揮中樞抑制作用可能與其減少腦中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān).為了初步探討SRP、SLP發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠藥效的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠腦部的GABA、Glu含量，并計(jì)算GABA/Glu值.Glu和GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中十分重要的氨基酸，GABA作為最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，在缺乏時(shí)會(huì)產(chǎn)生焦慮情緒[20].目前，常用巴比妥類催眠藥物就是通過增加GABA的神經(jīng)功能、促進(jìn)腦內(nèi)GABA釋放從而發(fā)揮作用，而Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[21]，可脫羧形成GABA，兩者與睡眠高度相關(guān)[22].本研究結(jié)果表明：SRP能增加腦內(nèi)GABA的含量，SRP、SLP均可顯著降低Glu含量，并且SRP、SLP 可增加GABA/Glu比值，提示SRP可能是通過增加抑制性遞質(zhì)GABA合成、減少興奮性遞質(zhì)Glu的代謝而起到中樞抑制作用的.值得一提的是，SLP雖然降低了Glu含量，但是卻沒有顯著升高GABA的含量，提示SLP可能是通過增加GABA合成量或者減少代謝量而維持其含量，具體調(diào)節(jié)GABA含量的方式以及相關(guān)鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討.

綜上所述，北五味子的根、葉多糖均具有鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用，本研究可為五味子資源的合理應(yīng)用及鎮(zhèn)靜催眠抗焦慮中藥的開發(fā)提供理論依據(jù).