西藍(lán)花種子EMS誘變條件篩選

李慧慧　丁強(qiáng)強(qiáng)　張書(shū)　張曉慧

摘 ? ?要：以西藍(lán)花種子為材料，設(shè)置6個(gè)甲基磺酸乙酯（EMS）含量（w，后同）梯度（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）與3個(gè)誘變時(shí)長(zhǎng)（4、8、12 h）的處理組合，分析誘變后的種子發(fā)芽和M1植株表型的變異情況。結(jié)果表明，隨著EMS含量的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，西藍(lán)花種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，相對(duì)致死率呈上升趨勢(shì)。0.6%EMS+12 h處理的西藍(lán)花種子成苗率為50%，得到的M1表型變異類(lèi)型包括花球嵌合體、葉色及葉形變異等。根據(jù)半致死率和M1誘變效果綜合考慮，0.6%的EMS誘變處理12 h可作為西藍(lán)花種子適宜的EMS誘變條件。

關(guān)鍵詞：西藍(lán)花;種子;EMS誘變;發(fā)芽率;表型

中圖分類(lèi)號(hào)：S635.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2022）06-035-06

Suitable conditions for EMS mutagenesis of broccoli seeds

LI Huihui DING Qiangqiang ZHANG Shu ZHANG Xiaohui

（1. Fuyang Academy of Agricultural Sciences， Fuyang 236065， Anhui， China; 2. Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230041， Anhui， China）

Abstract： To determine proper condition of EMS mutagenesis of broccoli （Brassica oleracea var. italica） seed， six EMS concentration （0， 0.2%， 0.4%， 0.6%， 0.8%， 1.0%） and three treatment periods （4 h， 8 h， 12 h） were tested. Germination rate of the treated seeds and phenotype variation of M1 plants were statistically analyzed. The results showed that， with the increase of EMS concentration and the extension of treatment time， the seed germination rate and vigor showed a downward trend， and the relative fatality rate showed an upward trend. The seedling establishment rate was 50% for the treatment 0.6% EMS + 12 h. M1 plant phenotypic variation included curd mosaic， leaf color and leaf shape variation. Based on the consideration of semi-lethal rate and the mutagenic effect of M1， the 0.6% EMS and 12 h are suitable EMS mutagenic condition for broccoli seeds. This result provides a reference for carrying out related research work on EMS mutation breeding of broccoli.

Key words：Broccoli; Seed; EMS mutagenesis; Germination rate; Phenotype

西藍(lán)花（Brassica oleracea var. italica）又稱綠花菜、青花菜等，屬十字花科甘藍(lán)的一個(gè)變種，其口感佳，且富含蘿卜硫苷、蛋白質(zhì)、維生素C等物質(zhì)，因而有“蔬菜皇冠”之稱[1-3]。西藍(lán)花起源于地中海，近年來(lái)在中國(guó)的栽培面積快速增長(zhǎng)。目前，西藍(lán)花種植產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，其面積約占全球的30%[4]。但在栽培過(guò)程中存在一個(gè)較為突出的問(wèn)題，即我國(guó)所使用的95%以上的西藍(lán)花種子主要從日本、荷蘭等國(guó)家進(jìn)口[4]。這個(gè)問(wèn)題產(chǎn)生的主要原因之一是，我國(guó)掌握的西藍(lán)花種質(zhì)材料較少，且這些材料間遺傳多樣性較低，難以育成有突破性的品種[4]。因此，創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)成為解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

誘變是植物獲得新基因和新性狀的手段之一，不僅比自然變異頻率大、突變類(lèi)型多，還可避免轉(zhuǎn)基因帶來(lái)的安全隱患問(wèn)題。甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）是一種不會(huì)造成染色體畸變，又可以誘導(dǎo)點(diǎn)突變的化學(xué)誘變劑[5]。目前，EMS已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于蘿卜、玉米、馬鈴薯、大豆、小麥和水稻等作物的誘變育種[6-11]。迄今，關(guān)于西藍(lán)花的研究多是在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、栽培技術(shù)和采后貯藏等方面[12-14]，關(guān)于EMS誘變西藍(lán)花種子的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者利用不同EMS含量（w，后同）與誘變時(shí)長(zhǎng)組合處理西藍(lán)花種子，并統(tǒng)計(jì)分析種子發(fā)芽情況與M1的表型變化情況，以此探究西藍(lán)花種子EMS誘變的適宜條件，為后續(xù)利用EMS誘變技術(shù)創(chuàng)制西藍(lán)花種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所使用的材料為耐寒優(yōu)秀西藍(lán)花雜交一代種子，來(lái)自日本坂田公司（SAKATA）。

1.2 方法

1.2.1 種子處理與發(fā)芽試驗(yàn) 發(fā)芽試驗(yàn)于2020年8月下旬在阜陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技園區(qū)連棟溫室中進(jìn)行，期間日均氣溫為28 ℃，土壤相對(duì)濕度保持在70%～80%。設(shè)置6個(gè)EMS含量梯度（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）與3個(gè)誘變時(shí)長(zhǎng)（4、8、12 h）不同組合處理西藍(lán)花種子，每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)50粒。不同梯度的EMS溶液使用含量0.1 mol·L-1、pH=7.0的磷酸緩沖液作為溶劑進(jìn)行配制。處理的具體方法為：每個(gè)處理的種子（150粒）分別放在濾袋中，在水中浸泡14 h進(jìn)行預(yù)處理，使其吸水萌動(dòng)，然后吸去種子表面水分再進(jìn)行不同組合的EMS處理。處理后的種子用流水沖洗2 h，取出輕微晾曬后播種在草炭土中。以后每3 d觀察并記錄1次西藍(lán)花種子發(fā)芽情況，且以0 梯度的EMS處理作為對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 觀察M1植株表型變異情況 2020年9月27日，苗齡30 d左右時(shí)，以行距60 cm、株距40 cm定植于普通塑料大棚中。以梯度為0的EMS處理的表型為對(duì)照，主要觀察記錄M1植株表型及花球表型變異情況，包括葉形、葉色、植株分枝、花球大小、花球顏色、蕾粒大小等。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)相關(guān)的指標(biāo) 發(fā)芽率/%=播后15 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100[15];相對(duì)發(fā)芽率/%=處理組的發(fā)芽率/對(duì)照組的發(fā)芽率×100[15];相對(duì)致死率/%=（1-相對(duì)發(fā)芽率）×100[15];成苗率/%=成苗株數(shù)/種子總數(shù)×100;變異率/%= 變異株數(shù)/總成苗株數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 22.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析，采用Excel及Origin 7.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含量EMS處理對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽動(dòng)態(tài)的影響

由圖1可以看出，與對(duì)照相似，低含量（0.2%和0.4%）的EMS處理4、8、12 h后，種子發(fā)芽基本在播后6 d完成，且集中在播后3 d。處理時(shí)間4 h時(shí)，當(dāng)EMS含量為0.6%時(shí)，種子發(fā)芽在播后6 d基本完成，集中在前3 d;EMS含量為0.8%時(shí)，種子發(fā)芽在播后6 d基本完成，但1～3 d種子發(fā)芽量與4～6 d較為接近;EMS含量為1.0%時(shí)，種子發(fā)芽在播后9 d基本完成，且4～6 d種子發(fā)芽數(shù)最多。8、12 h與0.6%、0.8%、1.0% EMS的組合處理中，種子發(fā)芽在播后9 d基本完成，除0.6%和0.8%處理8 h的1～3 d種子發(fā)芽量與4～6 d較為接近外，其他組合處理的種子發(fā)芽量集中在4～6 d。說(shuō)明較低含量的EMS溶液和較短的誘變時(shí)間對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽完成時(shí)間、發(fā)芽高峰期影響較小，較高含量（0.6%、0.8%和1.0%）的EMS處理時(shí)間較長(zhǎng)（8 、12 h）會(huì)導(dǎo)致西藍(lán)花種子發(fā)芽完成時(shí)間、發(fā)芽高峰期明顯推遲。

2.2 不同含量EMS處理對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽率的影響

由圖2可以看出，除0.4%EMS+12 h處理組合以外，較低含量的EMS（0.2%和0.4%）處理4 h、8 h和12 h種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率均與對(duì)照差異不顯著，各處理組合之間差異也不顯著，發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率均在90%以上。使用0.6%的EMS時(shí)，種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)致死率在處理4 h時(shí)與對(duì)照差異不顯著，但在處理8 h、12 h時(shí)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率顯著下降，不同的處理時(shí)間之間差異顯著。使用更高含量的EMS（0.8%和1.0%）時(shí)，處理4 h、8 h和12 h均與對(duì)照差異顯著，而且同含量下不同時(shí)間處理也差異顯著，均表現(xiàn)為隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)種子發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率顯著下降，相對(duì)致死率顯著上升。從圖2 也可以看出，EMS含量越高或處理時(shí)間越長(zhǎng)，西藍(lán)花種子發(fā)芽數(shù)就越少，1.0%EMS處理12 h后的種子發(fā)芽極少。綜上可知，隨著EMS含量及處理時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致西藍(lán)花種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率下降，相對(duì)致死率上升。

由表1可知，EMS處理的含量和時(shí)間對(duì)西藍(lán)花種子的發(fā)芽率影響均極顯著，兩者皆為影響西藍(lán)花種子發(fā)芽的主要因素，同時(shí)EMS含量和處理時(shí)間的交互作用對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽的影響也極顯著。因此，在使用EMS對(duì)西藍(lán)花種子進(jìn)行誘變時(shí)，應(yīng)綜合考慮EMS誘變含量和誘變時(shí)間。

2.3 不同含量EMS處理西藍(lán)花種子對(duì)田間性狀的影響

由圖3可知，誘變處理的西藍(lán)花M1植株整體長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于對(duì)照，且表現(xiàn)出整株變異、某一器官變異和某器官的一部分變異。西藍(lán)花M1表型變異主要集中在葉片和花球上，如葉片變圓、葉片皺縮卷曲、葉片部分（或邊緣）黃化或白化或黃綠化、花球顏色嵌合體、花球鵝黃色、花蕾變細(xì)小、花球小葉皺縮、花球變小、花莖黃化、花朵顏色變淺等，還有少數(shù)的植株變異，如分枝性變強(qiáng)、生長(zhǎng)點(diǎn)畸變等。

由表2可知，隨EMS處理含量的增加或者處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總表型變異率呈增加趨勢(shì)，成苗率呈下降趨勢(shì)。1.0%EMS+12 h處理下表型變異率高達(dá)80.00%，但成苗率僅有6.67%，且主要是畸變。EMS處理時(shí)間為8 h的組合，得到的表型變異類(lèi)型較多，包括花蕾細(xì)小、花球顏色變異、葉片顏色變異等?；ㄇ蚴俏魉{(lán)花最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，花球的誘變結(jié)果尤為重要。0.4%+8 h、0.6%+8 h、0.8%+8 h和0.4%+12 h EMS組合處理出現(xiàn)花蕾細(xì)小變異株分別為1、1、2、1棵。0.4%+8 h、0.6%+8 h、0.8%+8 h、0.6%+12 h、0.6%+4 h和0.8%+4 h EMS組合處理出現(xiàn)花球顏色嵌合體變異株分別為1、4、1、2、3、3棵，0.2%+8 h處理組合誘導(dǎo)1株西藍(lán)花整個(gè)花球變?yōu)轾Z黃色?？傮w上，0.6%+8 h、0.8%+8 h兩個(gè)EMS處理得到的植株中花蕾細(xì)小、花球顏色變異比例較高，畸變比例中等。

3 討論與結(jié)論

EMS處理是一種常用的誘變手段，不同作物或同種作物的不同器官對(duì)EMS誘變劑的敏感性存在一定的差異，因此相應(yīng)的適宜誘變條件也不同。在進(jìn)行EMS誘變時(shí)，大白菜種子的適宜條件為0.4%～0.6% EMS處理4 h，而大白菜花粉的適宜條件則為0.15% EMS處理45～60 min[16]。與楊楠等[15]、李林章等[17]及薛紅霞[18]的研究結(jié)果一致，隨著EMS含量的增加及誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，西藍(lán)花種子的發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的浸泡阻礙了種子的正常呼吸代謝過(guò)程，而高含量的誘變劑則產(chǎn)生毒害作用，從而抑制了種子萌發(fā)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，EMS含量、誘變時(shí)間以及兩者的交互作用均對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽率產(chǎn)生極顯著的影響。因此，在對(duì)西藍(lán)花種子進(jìn)行EMS誘變時(shí)應(yīng)綜合考慮EMS誘變含量和誘變時(shí)間。

適宜的誘變條件應(yīng)同時(shí)滿足較低的生理?yè)p傷和較高的突變頻率，一般以造成半致死率的條件作為適宜誘變條件[17]。前人報(bào)道中分別將發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、花粉活力、相對(duì)成苗率等指標(biāo)的半致死劑量作為最佳條件[20-24]。在本試驗(yàn)中，EMS含量為1.0%時(shí)，處理8 h和12 h的成苗率都非常低，且M1畸變株占比大。這可能是EMS含量較高，造成種子內(nèi)部生理性損傷較大，導(dǎo)致發(fā)芽率和成苗率低，不宜作為EMS誘導(dǎo)西藍(lán)花種子的適宜條件。其他誘變條件，如0.2%+8 h處理出現(xiàn)鵝黃色花球，0.4%+8 h、0.6%+8 h、0.8%+8 h處理出現(xiàn)花球顏色嵌合體和花蕾變細(xì)小，在以后的相關(guān)研究中可被利用，但這些組合中EMS含量較低或處理時(shí)間較短，種子損傷較小，發(fā)芽率和成苗率較高，在M1篩選過(guò)程中工作量較大。0.8% EMS處理12 h，西藍(lán)花種子的相對(duì)致死率為59.78%，但成苗率僅為30%，且突變體中主要是畸變株（占比96.88%），也不是最佳的EMS誘變條件。值得注意的是，0.6%+12 h組合處理的西藍(lán)花種子成苗率為50%，得到的M1表型包含多種變異，包括花球嵌合體、葉色及葉形變異等。據(jù)徐美隆[25]報(bào)道，EMS誘導(dǎo)麗格海棠的變異株系中35%～45%變異株系為嵌合體，且其中一些嵌合體變異性狀可以穩(wěn)定遺傳。因此，0.6%+12 h組合處理西藍(lán)花獲得的變異性狀也有可能穩(wěn)定遺傳，具有利用價(jià)值。

綜上所述，根據(jù)西藍(lán)花M1變異率和成活率綜合考慮，以50%成苗率作為半致死劑量，0.6%+12 h的EMS處理組合可初步作為西藍(lán)花種子的適宜誘變條件。本試驗(yàn)結(jié)果可為開(kāi)展西藍(lán)花EMS誘變育種相關(guān)研究工作提供理論參考。

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