甜瓜育種技術(shù)與方法研究進(jìn)展

宋正峰　劉樹(shù)森　夏連芹　高鵬　欒非時(shí)　劉釗

摘 ? ?要：系統(tǒng)綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外甜瓜育種技術(shù)與方法的研究進(jìn)展，特別是甜瓜二代與三代基因組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組與代謝組學(xué)研究方法，重要基因定位及前景選擇技術(shù)，DNA指紋圖譜及背景選擇技術(shù)，遺傳轉(zhuǎn)化體系、基因編輯等基因工程技術(shù)，以及雙單倍體育種等細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并對(duì)我國(guó)甜瓜育種技術(shù)與方法研究工作進(jìn)行了展望，以期為廣大甜瓜育種工作者提供參考。

關(guān)鍵詞：甜瓜;育種技術(shù)與方法;分子育種;生物技術(shù)育種

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2022）06-001-08

Advances of melon breeding technology and method

SONG Zhengfeng LIU Shusen XIA Lianqin GAO Peng LUAN Feishi LIU Zhao

（1. Shouguang Sanmu Seeding Co.， LTD， Shouguang 262704， Shandong， China; 2. Weifang College of Science and Technology， Weifang 262700， Shandong， China; 3. Horticulture and Landscape Architecture College， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， Heilongjiang， China）

Abstract： We reviewed the recent progress in the field of melon breeding technologies and methods with focuses on the research progress in the second and third generation of genome sequencing， transcriptomics， proteomics and metabolomics research methods， important trait discovery and foreground selection， DNA fingerprinting and background selection， genetic transformation， gene editing system and other genetic engineering technologies， doubled haploid breeding and other cell engineering technologies in melon. Finally， the research work on melon breeding technologies and methods in China was prospected. We hope to provide reference for melon breeders.

Key words： Melon; Breeding technology and methods; Molecular breeding; Biotechnology breeding

甜瓜（Cucumis melo L.）屬于世界十大水果型蔬菜，富含礦物質(zhì)、維生素等人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分，是人們生活中不可缺少的園藝產(chǎn)品，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的位置[1]，在世界園藝產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域也占有舉足輕重的地位。FAO統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)甜瓜生產(chǎn)面積與產(chǎn)量均居世界首位，2020年我國(guó)甜瓜生產(chǎn)面積38.8萬(wàn)hm（占世界總面積的36.31%），產(chǎn)量達(dá)1 386.5萬(wàn)t（占世界總產(chǎn)量的48.71%）?！笆濉币詠?lái)，經(jīng)過(guò)廣大甜瓜育種工作者的不懈努力，我國(guó)甜瓜遺傳學(xué)基礎(chǔ)、功能基因組學(xué)、育種技術(shù)等領(lǐng)域的研究水平已經(jīng)趕上乃至超越西班牙、美國(guó)、以色列、土耳其、日本、韓國(guó)等傳統(tǒng)甜瓜科研強(qiáng)國(guó)，處于世界前列。尤其是近3年來(lái)，我國(guó)學(xué)者創(chuàng)建了多種甜瓜關(guān)鍵性狀前景選擇技術(shù)體系及成熟的全基因組背景選擇技術(shù)體系，使甜瓜分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)日趨成熟;在甜瓜基因工程育種中實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)的突破;傳統(tǒng)育種結(jié)合分子育種手段創(chuàng)制出一批抗性好、品質(zhì)優(yōu)的育種材料，育成眾多優(yōu)質(zhì)、抗逆的甜瓜新品種，并在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用，促進(jìn)了甜瓜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，助力了脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興[2]。筆者對(duì)甜瓜育種技術(shù)與方法領(lǐng)域研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)著眼于最新研究成果及實(shí)用分子育種手段的闡述，以期為我國(guó)甜瓜育種工作者開(kāi)展分子育種研究提供參考。

1 甜瓜組學(xué)研究進(jìn)展

組學(xué)一般包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)。這些組學(xué)中基因組學(xué)是基礎(chǔ)，尤其是作物參考基因組的發(fā)布，為后續(xù)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、基因定位進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分子育種等研究奠定了基礎(chǔ)。而轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)則為挖掘關(guān)鍵基因、闡明基因功能提供了工具。

1.1 甜瓜參考基因組研究

2012年西班牙學(xué)者首次發(fā)表了甜瓜參考基因組（v3.5.1）[3]，該參考基因組采用雙單倍體厚皮甜瓜材料DHL92為材料，以羅氏454平臺(tái)為主要測(cè)序手段，基因組測(cè)序結(jié)果顯示，甜瓜核型為2n=2x=24，基因組規(guī)模約為375 Mb;2018年該團(tuán)隊(duì)在原有基礎(chǔ)上又發(fā)表了新版本的甜瓜參考基因組（v3.6.1）[4]，基因組和注釋信息質(zhì)量得以提升。參考基因組的發(fā)表使得大規(guī)模開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇成為可能，通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)了解育種材料遺傳背景、開(kāi)發(fā)實(shí)用分子標(biāo)記、進(jìn)行基因精細(xì)定位已經(jīng)成為常規(guī)研究手段。

近3年來(lái)，三代測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，2019年新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院伊鴻平團(tuán)隊(duì)利用第三代測(cè)序技術(shù)（SMRT）與Hi-C技術(shù)結(jié)合，拼接了更加完備的甜瓜參考基因組[5]，所用材料為厚皮甜瓜Payzawat，這是三代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于甜瓜基因組拼接的首次報(bào)道。2020年浙江大學(xué)張明方團(tuán)隊(duì)利用三代測(cè)序技術(shù)結(jié)合Hi-C輔助組裝方式完成了典型薄皮甜瓜材料HS的基因組組裝[6]。三代測(cè)序技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于具有較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，可以保證基因組拼接的完整性，便于比較不同材料或亞種間的染色體變異，為今后獲得高質(zhì)量參考基因組乃至泛基因組奠定基礎(chǔ)。

除了核基因組圖譜之外，在甜瓜細(xì)胞器基因組測(cè)序和組裝方面，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種團(tuán)隊(duì)對(duì)甜瓜細(xì)胞器基因組進(jìn)行了測(cè)序，并將之與核基因組進(jìn)行了比較分析，證明了在甜瓜進(jìn)化過(guò)程中，核基因組與細(xì)胞質(zhì)中的2個(gè)細(xì)胞器基因組之間發(fā)生了大量遺傳物質(zhì)交換[7]。最近，也有了對(duì)甜瓜野生近緣材料馬泡瓜葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序組裝的報(bào)道[8]。

1.2 甜瓜轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指用第二代測(cè)序等方法對(duì)生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行高通量定性、定量分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以快速挖掘差異表達(dá)基因并明確基因調(diào)控關(guān)系，甜瓜參考基因組數(shù)據(jù)的發(fā)表為甜瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、拼接及數(shù)據(jù)分析提供了便利，現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段已經(jīng)成為甜瓜重要基因挖掘、基因功能分析、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的重要手段。目前，針對(duì)甜瓜各種性狀的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)已有很多，包括甜瓜抗病[9]、脅迫響應(yīng)[10]、果實(shí)品質(zhì)[11]、發(fā)育[12]及花性別分化[13]等，這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)都可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究相關(guān)性狀并克隆基因奠定了基礎(chǔ)。除了利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段研究編碼基因的表達(dá)特性，還有學(xué)者關(guān)注miRNA等非編碼RNA的表達(dá)特性，由此衍生出了小分子RNA測(cè)序及降解組測(cè)序等技術(shù)[14-15]，這些手段為深入研究非編碼RNA功能提供了條件。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究只能揭示轉(zhuǎn)錄水平的差異，為了研究翻譯水平的調(diào)控，有些學(xué)者已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，如Serra-Soriano等[16]研究了甜瓜在病毒感染過(guò)程中韌皮部汁液的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于健康植株，病毒感染植株25個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度發(fā)生了顯著改變，其中的大多數(shù)蛋白質(zhì)參與氧化還原反應(yīng)與細(xì)胞凋亡過(guò)程，這些結(jié)果為闡明甜瓜抗病毒機(jī)制提供了幫助。以往蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段主要是蛋白質(zhì)雙向電泳，現(xiàn)在多為利用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（time of flight mass spectrometer，TOF）等高通量手段。目前，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究的主要問(wèn)題是，測(cè)序結(jié)果會(huì)給出很多差異表達(dá)基因，如何在這些大量基因中找到關(guān)鍵基因是未來(lái)研究的主要課題，結(jié)合遺傳連鎖圖譜以及基因/QTL定位研究，將有效縮小基因篩選范圍，將遺傳學(xué)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相互結(jié)合更容易發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因。

近年來(lái)，代謝組學(xué)成為學(xué)者越來(lái)越重視的研究手段，代謝組學(xué)通過(guò)質(zhì)譜等高通量測(cè)定植物代謝產(chǎn)物，甜瓜很多性狀都與代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，尤其是果實(shí)香氣、風(fēng)味與代謝物密不可分。得益于質(zhì)譜技術(shù)等功能越來(lái)越強(qiáng)大，儀器價(jià)格越來(lái)越低，代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為分析甜瓜復(fù)雜性狀的有力工具。比如，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所王懷松團(tuán)隊(duì)利用代謝組學(xué)手段分析了甜瓜果皮顏色的形成機(jī)制[17];Nagashima等[18]利用代謝組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段分析了甜瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中芳香氣體形成的機(jī)制。

另外，進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，表型組學(xué)（phenomics）的研究理念越來(lái)越受到重視。所謂表型組是指某一生物的全部性狀特征，而植物表型組學(xué)是研究植物生長(zhǎng)、表現(xiàn)和組成的科學(xué)，能夠有效追蹤基因型、環(huán)境因素和表型之間的聯(lián)系，是未來(lái)作物學(xué)研究和應(yīng)用的關(guān)鍵領(lǐng)域[19]。植物表型組學(xué)研究需要特定的自動(dòng)化儀器，對(duì)擬南芥等模式植物和水稻等株型、規(guī)模有限的作物已經(jīng)有比較成熟的方案，由于甜瓜表型豐富、株型復(fù)雜，目前還沒(méi)有甜瓜表型組學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，對(duì)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等方法的綜合利用越來(lái)越成熟，通過(guò)合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)可以為破解甜瓜復(fù)雜性狀形成機(jī)制、挖掘重要基因開(kāi)啟一條捷徑。

2 甜瓜重要基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇

2.1 甜瓜重要基因定位及前景選擇技術(shù)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，已經(jīng)在甜瓜的12條染色體上獲得了大量的重要性狀相關(guān)位點(diǎn)，涉及到的性狀包括甜瓜抗病性、果實(shí)品質(zhì)、發(fā)育等多個(gè)方面。表1總結(jié)了其中性狀貢獻(xiàn)率大、定位穩(wěn)定、定位區(qū)間相對(duì)精細(xì)并可以用于分子輔助育種的基因位點(diǎn)，可以利用這些位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)合適的分子標(biāo)記，完成特定性狀的前景選擇。

有了上述基因的序列信息即可設(shè)計(jì)分子標(biāo)記開(kāi)展前景選擇育種工作，也可以將多個(gè)優(yōu)良基因進(jìn)行整合實(shí)現(xiàn)分子聚合育種。在分子標(biāo)記方面，以SSR為代表的第二代分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用比較廣泛。但最新挖掘的功能基因大多數(shù)是以SNP、InDel等第三代分子標(biāo)記進(jìn)行定位的，所以直接應(yīng)用位于基因上或與基因緊密連鎖的第三代分子標(biāo)記進(jìn)行選擇育種越來(lái)越成為主流。目前，以SNP為代表的第三代分子標(biāo)記在甜瓜育種實(shí)踐中主要基因分型手段包括以下幾種：（1）SNP-CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence，酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列）標(biāo)記，就是將SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為CAPS標(biāo)記，通過(guò)PCR之后限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行基因分型的手段[26]，該方法便于操作，但SNP位點(diǎn)須位于限制性酶切位點(diǎn)上;（2）real-time PCR，利用Taqman探針等手段進(jìn)行SNP基因分型[57]，該方法依賴于real-time PCR儀，適用于樣本規(guī)模較大但標(biāo)記數(shù)量較少的情況;（3）LGC-KASP（kompetitive allele specific PCR，競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR）是近年興起的高度自動(dòng)化相對(duì)高通量的SNP基因分型手段[58]，該手段依賴于儀器，且儀器價(jià)格較貴;（4）基因芯片，是自動(dòng)化程度水平很高和試驗(yàn)成本最低的高通量SNP基因分型手段[59]，但芯片設(shè)計(jì)成本很高，在甜瓜上適用于大規(guī)模基因分型芯片的報(bào)道還很少。上述方法需育種者結(jié)合自身情況靈活運(yùn)用。

2.2 甜瓜DNA指紋圖譜及背景選擇技術(shù)

分子標(biāo)記除了可以進(jìn)行基因定位和選擇育種外，也可以廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定。2012年，Gao等[60]通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)主栽甜瓜品種的指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)甜瓜種子市場(chǎng)存在較多同物異名、同名異物現(xiàn)象，并得出我國(guó)薄皮甜瓜遺傳背景相當(dāng)狹窄的結(jié)論。為了解決這一系列問(wèn)題，他們從1219個(gè)SSR中篩選到18對(duì)SSR引物作為DNA指紋圖譜的核心引物，利用該核心引物構(gòu)建了471份中國(guó)甜瓜主栽品種與骨干親本的DNA核酸指紋圖譜，這是第一套甜瓜分子指紋圖譜系統(tǒng)，可以區(qū)分主流商業(yè)甜瓜品種，并且利用其中個(gè)別多態(tài)性標(biāo)記可以快速在雜交種中找到混雜的母本種子，為種質(zhì)資源鑒定提供了依據(jù)。該系統(tǒng)主要有2個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是核心標(biāo)記為SSR標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單，尤其育種企業(yè)使用比較便利;二是標(biāo)記多態(tài)性信息豐富且覆蓋甜瓜全部12條染色體，品種及種質(zhì)資源區(qū)分效果較好。

但由于核心標(biāo)記數(shù)量較少，上述系統(tǒng)作為快速鑒定種質(zhì)資源尚可，難以作為全基因組背景選擇的工具。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，尤其是近5年高通量測(cè)序及基因分型技術(shù)的普及，以SNP為代表的第三代分子標(biāo)記逐漸代替SSR標(biāo)記作為甜瓜種質(zhì)資源鑒定的主要手段。2019年出現(xiàn)了利用32個(gè)核心SNP引物的甜瓜分子指紋圖譜技術(shù)[61]。

隨著可以應(yīng)用的多態(tài)性分子標(biāo)記越來(lái)越多，標(biāo)記覆蓋染色體的密度越來(lái)越大，分子指紋圖譜技術(shù)可以過(guò)渡為背景選擇技術(shù)，實(shí)現(xiàn)甜瓜育種的全基因組選擇（genomic selection，GS）。該技術(shù)是利用覆蓋全基因組的高密度標(biāo)記進(jìn)行選擇育種的新方法，利用全基因組背景選擇結(jié)合個(gè)別優(yōu)良性狀的前景選擇，可以快速將優(yōu)良性狀（如抗性）導(dǎo)入育種材料中，實(shí)現(xiàn)骨干親本的快速改良。背景選擇結(jié)合前景選擇可通過(guò)早期選擇縮短世代間隔，保證育種值（genomic estimated breeding value，GEBV）估計(jì)的準(zhǔn)確性等，加快遺傳研究進(jìn)展，尤其對(duì)低遺傳力、難測(cè)定的復(fù)雜性狀具有較好的預(yù)測(cè)效果，真正實(shí)現(xiàn)了全基因組選擇技術(shù)指導(dǎo)育種實(shí)踐。目前，國(guó)內(nèi)外各主要甜瓜育種單位正努力整合、建立成熟的甜瓜背景選擇技術(shù)體系，將用于甜瓜育種實(shí)踐。

前景選擇結(jié)合背景選擇的高效分子育種策略需要高通量基因分型手段，SNP等第三代分子標(biāo)記是最優(yōu)選擇。目前高通量SNP分型手段主要有LGC-KASP和基因芯片，其中，LGC-KASP已得到很好應(yīng)用，目前還罕有甜瓜SNP分型芯片的報(bào)道。

以SSR為代表的第二代分子標(biāo)記和SNP為代表的第三代分子標(biāo)記相比較，第二代分子標(biāo)記基因分型技術(shù)簡(jiǎn)單、操作要求與成本較低，適合少數(shù)樣品的快速鑒定，而第三代分子標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)高通量基因分型，技術(shù)和設(shè)備要求高，育種工作者可以根據(jù)實(shí)際情況靈活應(yīng)用。相信指紋圖譜及背景選擇技術(shù)將會(huì)在甜瓜育種、品種鑒定、資源利用等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

3 甜瓜基因工程

3.1 甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系

國(guó)際上甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究開(kāi)始于20世紀(jì)90年代[62-64]，國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究也較早，成功轉(zhuǎn)化甜瓜的歷史可以追溯到1994年，新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院獲得了抗黃瓜花葉病毒轉(zhuǎn)基因植株[65]。特別是2014年以來(lái)，甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，相關(guān)研究報(bào)道較多[66-67]。

甜瓜基因工程的應(yīng)用有以下2個(gè)方面：一是甜瓜抗病，如將病毒衣殼蛋白基因轉(zhuǎn)入甜瓜達(dá)到抗病毒病的目的[65，68]，以及將幾丁質(zhì)酶等抗真菌基因轉(zhuǎn)入甜瓜達(dá)到抗真菌病的目的[69];二是對(duì)乙烯代謝相關(guān)基因進(jìn)行改良，乙烯是植物中的重要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參與果實(shí)成熟、形態(tài)建成、花發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，有學(xué)者將乙烯合成途徑中關(guān)鍵酶基因的反義序列轉(zhuǎn)入甜瓜，達(dá)到降低果實(shí)乙烯含量、增強(qiáng)甜瓜耐貯藏性進(jìn)而延長(zhǎng)貨架期的目的[70]，還有將甜瓜中花發(fā)育關(guān)鍵乙烯相關(guān)基因CmACS-3進(jìn)行超量表達(dá)，達(dá)到增加兩性花數(shù)、促進(jìn)兩性花成熟效果的報(bào)道，該研究對(duì)育成易坐果、早熟、豐產(chǎn)的甜瓜材料具有重要意義[67]。目前，這些報(bào)道中所利用的遺傳轉(zhuǎn)化方法均為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，具體方式主要有子葉/子葉節(jié)法[65-67]、子房注射法[69]以及花粉管通道法[70]。上述方法中使用最多、轉(zhuǎn)化效率最穩(wěn)定、應(yīng)用潛力最大的是以子葉節(jié)為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。

植物基因工程技術(shù)與理論已經(jīng)成熟，然而其在甜瓜領(lǐng)域的應(yīng)用與其他作物相比還不夠廣泛，主要原因是雖然甜瓜已經(jīng)獲得高效的再生體系[71]，但缺乏高效、穩(wěn)定、重復(fù)性好的遺傳轉(zhuǎn)化體系，國(guó)內(nèi)很多研究團(tuán)隊(duì)正在該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究，相信近期會(huì)有所突破。

3.2 甜瓜基因編輯技術(shù)

近5年來(lái)，隨著甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的日益完善，以CRISPR-Cas9系統(tǒng)為代表的基因編輯技術(shù)在育種和基礎(chǔ)研究中顯示出越來(lái)越大的潛力和優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)有學(xué)者進(jìn)行了甜瓜基因編輯的探索，如王雪等[72]構(gòu)建了甜瓜ACC合成酶CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因編輯載體;王丹等[73]構(gòu)建了甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas9敲除載體。但上述2個(gè)例子只有基因編輯載體構(gòu)建的報(bào)道，未見(jiàn)對(duì)甜瓜完成基因編輯并產(chǎn)生表型的報(bào)道。究其原因是目前基因編輯理論、方法和載體已比較成熟，但現(xiàn)有基因編輯體系依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，還缺乏比較高效、穩(wěn)定的甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。未來(lái)，隨著成熟甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建，基因編輯技術(shù)將會(huì)在育種實(shí)踐中發(fā)揮重大作用。

4 甜瓜細(xì)胞工程及倍性育種技術(shù)

總體上說(shuō)，甜瓜細(xì)胞工程及倍性育種發(fā)展較為緩慢，在育種中并沒(méi)有得到大規(guī)模應(yīng)用，現(xiàn)就該領(lǐng)域的研究歸納總結(jié)如下。

4.1 甜瓜細(xì)胞工程技術(shù)

目前，在甜瓜細(xì)胞工程領(lǐng)域進(jìn)行的研究主要是甜瓜原生質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和融合。國(guó)際上甜瓜原生質(zhì)體培養(yǎng)研究始于1984年，西班牙學(xué)者率先發(fā)表了甜瓜原生質(zhì)體培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)的方法[74]，而國(guó)內(nèi)相關(guān)研究晚于國(guó)外5年[75]。單純的原生質(zhì)體培養(yǎng)并獲得再生植株的理論和實(shí)踐意義并不大，所以學(xué)者開(kāi)始進(jìn)行原生質(zhì)體細(xì)胞融合的研究，主要對(duì)西瓜、甜瓜2種葫蘆科主要作物的原生質(zhì)體進(jìn)行融合[76-77]，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的手段包括聚乙二醇介導(dǎo)的化學(xué)融合[77]和電融合[76]。目前還沒(méi)有通過(guò)細(xì)胞融合獲得甜瓜雜種植株的報(bào)道，其主要原因是西瓜與甜瓜親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交細(xì)胞染色體組難以穩(wěn)定遺傳，其后代性狀分離嚴(yán)重、與常規(guī)材料雜交困難等。反之，利用甜瓜與其近緣野生種的原生質(zhì)體雜交有可能獲得成功，可以通過(guò)這個(gè)方式快速獲得野生種優(yōu)異性狀，有條件的機(jī)構(gòu)可以考慮開(kāi)展此項(xiàng)研究工作。

原生質(zhì)體培養(yǎng)的另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是通過(guò)原生質(zhì)體完成誘變或外源基因?qū)?，隨著化學(xué)誘變、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化等手段的完善，原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)在上述領(lǐng)域已沒(méi)有技術(shù)優(yōu)勢(shì)，所以較少有人關(guān)注于此。

4.2 甜瓜雙單倍體育種

雙單倍體（doubled haploid或dihaploid，DH）即加倍后的單倍體，雙單倍體技術(shù)可快速獲得基因型純合的植株。雙單倍體技術(shù)在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域可快速獲得永久作圖群體（DH群體）;在育種實(shí)踐上，雙單倍體技術(shù)可快速純合育種材料，固定優(yōu)異基因。所以甜瓜雙單倍體技術(shù)具有巨大理論與實(shí)踐意義。

雙單倍體技術(shù)的第一步是獲得單倍體，而后再用秋水仙素對(duì)單倍體枝條進(jìn)行加倍，加倍后枝條上的花進(jìn)行自交授粉即可獲得穩(wěn)定的雙單倍體后代。早在1987年法國(guó)學(xué)者利用輻射后的甜瓜花粉進(jìn)行授粉，再通過(guò)胚挽救手段獲得甜瓜單倍體，進(jìn)而用秋水仙素對(duì)單倍體進(jìn)行加倍即可獲得雙單倍體[78]。受制于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，其單倍體誘導(dǎo)和加倍效率不高。2010年后，甜瓜雙單倍體的報(bào)道逐漸增多，但均為國(guó)外學(xué)者尤其是西班牙學(xué)者完成[79-80]，成功的雙單倍體研究普遍采用適合歐洲栽培的厚皮甜瓜材料作為親本進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)和加倍。我國(guó)這方面的報(bào)道還比較少[81]。由于國(guó)內(nèi)甜瓜栽培類型豐富，涵蓋薄皮甜瓜和多種類型厚皮甜瓜，因此，迫切需要探索一種適合各種甜瓜類型的雙單倍體誘導(dǎo)技術(shù)。

4.3 三倍體無(wú)籽甜瓜育種

將普通二倍體用秋水仙素處理即可獲得四倍體，四倍體親本與二倍體親本雜交可產(chǎn)生三倍體雜種，三倍體植株在進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)會(huì)出現(xiàn)聯(lián)會(huì)紊亂的情況，所以三倍體難以形成種子。目前，在葫蘆科作物上西瓜三倍體的應(yīng)用已很廣泛。不同于三倍體無(wú)籽西瓜已經(jīng)形成了較大的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，三倍體甜瓜的研究很少，這主要是因?yàn)樘鸸系姆N子和可食用部分是分開(kāi)的，無(wú)籽甜瓜經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高。

目前已報(bào)道的三倍體無(wú)籽甜瓜只有哈甜3號(hào)薄皮甜瓜品種[82]，三倍體薄皮甜瓜無(wú)成熟種子，具有甜度高、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，但由于三倍體甜瓜種子出芽率低，限制了更大面積的推廣。

5 甜瓜育種技術(shù)與方法展望

隨著越來(lái)越多的甜瓜關(guān)鍵基因被克隆，今后除了繼續(xù)發(fā)掘、克隆、利用單基因決定性狀的關(guān)鍵基因，未來(lái)甜瓜育種技術(shù)研究還可以著眼于以下幾個(gè)領(lǐng)域：一是復(fù)雜性狀決定基因的克隆和利用;二是關(guān)注已克隆基因的功能解析，在明晰基因功能研究基礎(chǔ)上可以利用轉(zhuǎn)基因、基因編輯等手段改良性狀;三是最新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化越來(lái)越快，與育種領(lǐng)域結(jié)合越來(lái)越緊密，包括三代測(cè)序、代謝組學(xué)、基因編輯、高通量表型分析系統(tǒng)等一系列新技術(shù)逐漸在甜瓜分子育種上成熟并顯示出優(yōu)勢(shì)，研究者應(yīng)充分利用;四是整合已有研究成果，建立多套相關(guān)性狀前景選擇技術(shù)體系，充分利用高通量基因分型平臺(tái)，整合出甜瓜背景選擇技術(shù)體系，形成高效分子育種新模式，真正使甜瓜育種進(jìn)入分子育種時(shí)代。

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