透明劑對(duì)生物組織光學(xué)相干層析成像的影響研究

王凱聰，房文匯，鄒鵬，陸冬筱，李金華

(納米光子學(xué)與生物光子學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，跨尺度微納制造教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春理工大學(xué)，中國(guó) 長(zhǎng)春，130022)

1 引言

光學(xué)相干層析(Optical Coherence Tomography，OCT)技術(shù)最初于1991麻省理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)研制提出[1]。OCT作為一種新型的成像技術(shù)，是一種非接觸式成像技術(shù)，與其他生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像方式相比，具有無(wú)損、非侵入式、高分辨率和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[2]。OCT技術(shù)最早在眼科方面[3]得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)其應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)展到了心血管、呼吸道等散射型組織，以及皮膚科、牙科、材料檢測(cè)等領(lǐng)域[4-6]。

生物光學(xué)成像技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床上的治療和診斷是當(dāng)前快速發(fā)展的國(guó)際前沿領(lǐng)域。然而，由于生物組織具有的高散射及渾濁特性，制約了其獲取高對(duì)比度及組織深層結(jié)構(gòu)和功能圖像信息，使得其只能應(yīng)用于活體組織的淺表部位。基于此提出了生物組織光學(xué)透明技術(shù)(Tissue Optical Clearing，TOC)。這項(xiàng)技術(shù)最早是由俄羅斯Tuchin教授于1997年提出[7]，通過(guò)向生物組織施加高滲透性、高折射率、生物相溶性較好的光學(xué)透明劑(Optical Clearing Agents，OCA)，有效地降低組織的高散射特性，進(jìn)而增強(qiáng)光在組織中的穿透深度。研究的對(duì)象涉及離體與在體皮膚組織、乳腺、眼睛鞏膜、腫瘤組織、胃、腎臟等[8-10]，其中皮膚組織作為疾病診斷和治療的靶向組織研究的較多。

到目前為止，生物組織光透明研究大都考慮了光穿透深度隨滲透時(shí)間的變化，而忽略了OCA滲透過(guò)程中信號(hào)強(qiáng)度隨測(cè)量深度的空間分布。已知OCA向組織的擴(kuò)散是一個(gè)漸變過(guò)程，相同深度的生物組織內(nèi)OCA的濃度會(huì)隨著時(shí)間不斷增加；相同時(shí)刻，隨著深度的增加，濃度會(huì)逐漸減小。故對(duì)于不同深度，OCA的作用效果不同。本研究結(jié)果為了解OCA濃度及作用時(shí)間對(duì)于不同深度最優(yōu)選擇，提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)參考。證明了OCA濃度及作用時(shí)間對(duì)提高OCT圖像信號(hào)強(qiáng)度存在重要的相關(guān)性，進(jìn)一步理解了OCA的作用機(jī)制，對(duì)于其在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用有一定的指導(dǎo)作用。

2 光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)與散射機(jī)理

2.1 光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)

譜域OCT(Spectral Domain OCT，SD-OCT)于1995年由Fercher[11]等首次提出，如圖1所示，SD-OCT 系統(tǒng)由光源、邁克爾遜干涉儀、探測(cè)器等組成。參考光束被平面鏡反射并與樣品產(chǎn)生的背散射光在光纖耦合器內(nèi)進(jìn)行干涉，形成攜帶樣品內(nèi)部信息的干涉光，之后聚焦到CCD相機(jī)上，實(shí)現(xiàn)干涉光譜信號(hào)的探測(cè)。

圖1 頻域OCT系統(tǒng)原理圖Fig.1 The schematic of SD-OCT system

假設(shè)生物組織的反射點(diǎn)是離散的，那么其反射率則可以表示為與深度有關(guān)的函數(shù)R(Δz)，其

中Δz為參考臂與樣品臂的光程差。根據(jù)低相干干涉理論，CCD上探測(cè)到的光譜信號(hào)可以用下式表示[12]：

i(Δz)=AρF-1s(k)?[F-1DC+BF-1CC]

(1)

其中A、B為常數(shù)，ρ是探測(cè)器響應(yīng)度，RR為參考鏡的反射率，F(xiàn)-1s(k)是光源電場(chǎng)振幅的傅里葉逆變換，k為波數(shù)，可以看出OCT信號(hào)強(qiáng)度與被測(cè)物體的反射率相關(guān)。

2.2 光與生物組織的相互作用

當(dāng)一束光入射到生物組織上時(shí)，理論上會(huì)產(chǎn)生反射、吸收和散射這三個(gè)效應(yīng)，可能會(huì)影響光束的傳播路徑，這三者之間的關(guān)系如圖2所示。

圖2 光在組織中傳輸效應(yīng)示意圖Fig.2 Schematic of the light transmission in tissue

①反射性質(zhì)：

反射光被探測(cè)器探測(cè)，形成i(k)。根據(jù)Fresnel公式，當(dāng)光垂直入射時(shí)，反射系數(shù)可以表示為：

(2)

可以看出反射系數(shù)與物體折射率有關(guān)，根據(jù)公式(1)可知，改變物體折射率可以改變OCT信號(hào)強(qiáng)度。

②散射效應(yīng)

本次實(shí)驗(yàn)所用的OCT系統(tǒng)光源中心波長(zhǎng)為1300 nm，在此波長(zhǎng)時(shí)，生物組織的吸收較低，散射成為限制光在組織中穿透深度的主要因素[12]。在單次散射模型中，散射對(duì)光強(qiáng)所造成的削弱與損失，可以用Lambert-Beer公式來(lái)近似描述[13]：

i(z)=i0e-μsz

(3)

其中z表示待測(cè)位置距離光源的距離，i0是入射光的光強(qiáng)，μs是介質(zhì)的散射系數(shù)。根據(jù)Mie散射理論[14]，無(wú)相互作用顆粒系統(tǒng)的約化散射系數(shù)被定義為：

(4)

2.3 光學(xué)透明劑的作用機(jī)理

目前組織光透明的作用機(jī)制主要包括以下三種假說(shuō)[15-17]：

①無(wú)形成分與有形成分折射率匹配

OCA首先從生物組織外部向細(xì)胞與細(xì)胞間隙中擴(kuò)散，然后開(kāi)始從細(xì)胞膜外部向細(xì)胞基質(zhì)中不斷的擴(kuò)散。此過(guò)程導(dǎo)致各物質(zhì)間的折射率差異降低，組織的透明度被增強(qiáng)。

②失水效應(yīng)

OCA向生物組織及細(xì)胞內(nèi)滲透的同時(shí)必然伴隨水分子的交換，因此組織和細(xì)胞內(nèi)部折射率低的水逐漸排出，提高折射率匹配度。

③膠原蛋白結(jié)構(gòu)改變

OCA與膠原蛋白纖維相互作用，導(dǎo)致膠原蛋白可逆溶解，從而降低其折射率，提高折射率匹配程度。

結(jié)合公式(4)可知折射率匹配是TOC技術(shù)的基本原理，加入OCA后，增加了折射率的匹配程度，使m→1。μs就變得越小，這使得光在生物組織中表現(xiàn)出較深的穿透深度。

3 材料和方法

3.1 樣品的制備：

實(shí)驗(yàn)中所有豬皮均密封以防止自然失水，后保存在4℃的環(huán)境下，在12小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前把樣品置于常溫下15分鐘，使用清水清洗豬皮表面的污垢，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品被切成面積為3.0 cm×3.0 cm的方塊，平均厚度為0.5 cm。選取PEG-400、PEG-200、甘油、丙二醇的四種溶液，分別與水配置成30～100%共8種不同比例的溶液用作OCA，每隔10分鐘就用OCT系統(tǒng)測(cè)量豬皮圖像，總共持續(xù)2小時(shí)，觀(guān)察OCA的滲透過(guò)程。

3.2 OCT系統(tǒng)

本次實(shí)驗(yàn)使用的OCT系統(tǒng)是THORLABS的TELESTO，光源中心波長(zhǎng)1300 nm，水溶液中理論成像深度為3.5 mm，軸向分辨率為5.5 μm，A掃描速率在5.5～91 kHz之間。

4 分析與討論

4.1 不同濃度透明劑作用下的圖像和一維信號(hào)

通過(guò)對(duì)離體豬皮作用不同濃度與種類(lèi)的OCA，并進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察，可得多組OCT掃描圖像。其中PEG-400作用豬皮的圖像如圖3所示。可以看出離體豬皮作用OCA后，隨著時(shí)間的增大成像深度均有所增加，濃度越高增強(qiáng)效果越強(qiáng)。但仔細(xì)觀(guān)察OCT圖像，在豬皮的淺層部位信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的增大而降低，為了更好的理解這種現(xiàn)象需要對(duì)圖像進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖3 不同濃度PEG-400作用豬皮的OCT圖像Fig.3 OCT images of porcine skin samples with different concentrations of PEG-400

通過(guò)圖像識(shí)別算法識(shí)別豬皮表面，將OCT的所有A 掃描重新對(duì)準(zhǔn)表面，重建出新的圖像。對(duì)重建后的OCT圖像所有A掃描進(jìn)行平均，得到一維信號(hào)，以抑制斑點(diǎn)噪聲、減少偽影。就可以的得到如圖4這樣OCT信號(hào)強(qiáng)度隨深度的變化曲線(xiàn)，后續(xù)根據(jù)這樣的曲線(xiàn)進(jìn)行分析。

圖4 正常豬皮的一維OCT信號(hào)Fig.4 1-D OCT signal of normal porcine skin

提取不同深度下的信號(hào)強(qiáng)度用來(lái)比較不同濃度OCA對(duì)豬皮透明效果的影響，以PEG-400為例，具體數(shù)據(jù)如圖5所示。可以看出，不同深度OCA作用效果不同：

①如圖5(a)所示，淺層皮膚0.2 mm處，高濃度情況下隨著時(shí)間增大信號(hào)強(qiáng)度減弱，低濃度的情況下信號(hào)變化較小。

②如圖5(b-d)所示，中層皮膚0.4～0.8 mm處，信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大值之后開(kāi)始下降，濃度越高變化幅度越大，最大值越大。

③如圖5(e-f)所示，深層皮膚的1.0～1.4 mm處，OCT信號(hào)強(qiáng)度一直在增加，濃度越高增加的越明顯。

圖5 不同濃度PEG-400作用下不同深度豬皮信號(hào)強(qiáng)度變化。(a-f)表示0.2 mm，0.4 mm，0.6 mm，0.8 mm，1.0 mm，1.4 mm深度Fig.5 Intensity changes of porcine skin at different depths with different concentrations of PEG-400.(a-f) shows 0.2 mm, 0.4 mm, 0.6 mm, 0.8 mm, 1.0 mm, 1.4 mm depth

根據(jù)文獻(xiàn)的結(jié)果表明，OCA向皮膚的擴(kuò)散是一個(gè)漸變過(guò)程，不同深度的濃度不同。相同深度的皮膚內(nèi)OCA濃度會(huì)隨著時(shí)間不斷增加；相同時(shí)刻，隨著深度的增加，OCA濃度會(huì)逐漸減小[18]。再結(jié)合第2節(jié)的討論可知，OCA作用皮膚時(shí)不僅會(huì)降低組織散射使光散射幾率減小，增強(qiáng)OCT信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)也會(huì)降低皮膚局部反射率致使信號(hào)強(qiáng)度降低。故OCT信號(hào)強(qiáng)度取決于光在傳播路徑中散射造成的衰減和觀(guān)測(cè)點(diǎn)的局部反射率兩個(gè)方面，由此可以得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：

①淺層皮膚

皮膚表面與測(cè)量位置的距離較短，光在傳輸路徑上的衰減對(duì)OCT圖像的影響較小，加入高折射率溶液后導(dǎo)致皮膚局部反射率降低使得淺層反射信號(hào)減小。高濃度溶液相比低濃度溶液擁有更大的折射率，從而使OCT信號(hào)強(qiáng)度降低得更快。

②中層皮膚

皮膚表面與測(cè)量位置的距離較長(zhǎng)，光在傳輸路徑上的衰減對(duì)OCT圖像的影響較大，因此降低衰減顯著增加了皮膚中層反射信號(hào)。但隨著滲透時(shí)間的增加，皮膚中層的OCA濃度增加，使得局部折射率增大反射率降低，又導(dǎo)致OCT信號(hào)強(qiáng)度降低。

③深層皮膚

因?yàn)槠つw深度較深，其中OCA的濃度一直不高，使得OCT信號(hào)強(qiáng)度一直在增加。因高濃度溶液擁有更大的折射率能更加迅速的改變背景折射率，故OCA濃度越高增強(qiáng)效果越明顯。

4.2 不同種類(lèi)透明劑作用下信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比

為了更好的分析皮膚的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與可能存在的病變，用OCA盡可能的提升OCT信號(hào)強(qiáng)度。把四種OCA作用下信號(hào)變化最大值提取出來(lái)進(jìn)行比較(圖6)，就可以分析不同OCA的作用效果。

圖6 不同OCA作用下豬皮信號(hào)強(qiáng)度變化最大值Fig.6 Maximum intensity changes of porcine skin with different OCA

現(xiàn)階段針對(duì)OCA的篩選，主要考慮高折射率與高滲透性的兩方面性質(zhì)。高折射率溶液進(jìn)入組織替換組織間液提高組織背景折射率，以及高滲性透溶液引起組織脫水，表1列出了四種試劑100%濃度情況下的折射率、分子量、以及羥基的數(shù)目。

表1 不同醇的物理特性[17]Table.1 Characteristics of the different alcohols

從上表的數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：

①三元醇的光透明效果好于二元醇

Hirshburg[16]認(rèn)為OCA中的羥基可以與膠原分子形成氫鍵，并取代水化膜中的水分子，破壞膠原纖維的高階散射結(jié)構(gòu)。使得膠原纖維解離成為更小的膠原原纖維，降低膠原纖維的折射率，提高折射率匹配。如果醇有更多的羥基，水化膜的破壞就更大，因此，形成氫鍵橋的傾向被認(rèn)為是光學(xué)透明效果的一個(gè)重要因素。

②折射率越大透明效果越好

選擇的醇類(lèi)試劑的折射率均高于皮膚，可以看出折射率越大透明效果越好，這是因?yàn)椋阂环矫?，高折射率溶液擁有更大的折射率能更加迅速的改變背景折射率；同時(shí)對(duì)于同一種溶液，高折射率相比低折射率擁有更大的濃度，從而能更快的滲透入皮膚中并且引起脫水。

③分子量不直接影響光透明效果

因?yàn)樾》肿游镔|(zhì)較易穿透皮膚，表明分子量可能會(huì)通過(guò)影響 OCA 在皮膚的穿透力而影響其光透明效果。然而結(jié)果表明分子量不直接影響光透明劑的作用效果，這可能是因?yàn)榉肿恿坎⒉皇怯绊懲该餍?yīng)的唯一原因，多種機(jī)理共同作用造成了這樣的結(jié)果。

④淺層與深層位置透明效果相反

根據(jù)第2節(jié)的分析，對(duì)于淺層皮膚，OCT信號(hào)強(qiáng)度主要取決于反射率的降低。根據(jù)反射理論可知，皮膚的折射率越大，局部反射率越小。折射率越高的試劑越能降低皮膚的反射率，也就形成了與深層皮膚透明效果相反的結(jié)果。

6 結(jié)論

本文將不同濃度與種類(lèi)的OCA作用于離體豬皮，并用OCT進(jìn)行2小時(shí)長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察。定量分析其作用效果，比較不同時(shí)間段、不同OCA作用下的信號(hào)強(qiáng)度變化。發(fā)現(xiàn)不同濃度與種類(lèi)的OCA均能有效的提高OCT的成像深度，并且濃度越高，透明效果越好。但皮膚不同深度的強(qiáng)度變化并不一致，所以想要觀(guān)察不同深度的組織結(jié)構(gòu)或者病變，則需要選取適當(dāng)?shù)腛CA與作用時(shí)間。

該研究對(duì)提升OCT技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)成像中能力，以及在將來(lái)的皮膚疾病診斷中，OCA種類(lèi)及作用時(shí)間的選擇提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。拓展了OCT成像技術(shù)在臨床皮膚病成像和診斷中應(yīng)用能力，對(duì)于OCA在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用有一定的指導(dǎo)作用。但我們實(shí)驗(yàn)中的OCA均作用于離體皮膚，對(duì)于在體皮膚是否會(huì)有相同效果還需要進(jìn)一步的探索。