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    透明劑對生物組織光學相干層析成像的影響研究

    2022-07-09 03:17:28王凱聰房文匯鄒鵬陸冬筱李金華
    光散射學報 2022年1期
    關鍵詞:深度生物效果

    王凱聰,房文匯,鄒鵬,陸冬筱,李金華

    (納米光子學與生物光子學吉林省重點實驗室,跨尺度微納制造教育部重點實驗室,長春理工大學,中國 長春,130022)

    1 引言

    光學相干層析(Optical Coherence Tomography,OCT)技術最初于1991麻省理工學院的研究團隊研制提出[1]。OCT作為一種新型的成像技術,是一種非接觸式成像技術,與其他生物醫(yī)學光學成像方式相比,具有無損、非侵入式、高分辨率和高靈敏度等優(yōu)點[2]。OCT技術最早在眼科方面[3]得到了廣泛應用。近年來其應用范圍也逐漸擴展到了心血管、呼吸道等散射型組織,以及皮膚科、牙科、材料檢測等領域[4-6]。

    生物光學成像技術應用于醫(yī)學臨床上的治療和診斷是當前快速發(fā)展的國際前沿領域。然而,由于生物組織具有的高散射及渾濁特性,制約了其獲取高對比度及組織深層結構和功能圖像信息,使得其只能應用于活體組織的淺表部位。基于此提出了生物組織光學透明技術(Tissue Optical Clearing,TOC)。這項技術最早是由俄羅斯Tuchin教授于1997年提出[7],通過向生物組織施加高滲透性、高折射率、生物相溶性較好的光學透明劑(Optical Clearing Agents,OCA),有效地降低組織的高散射特性,進而增強光在組織中的穿透深度。研究的對象涉及離體與在體皮膚組織、乳腺、眼睛鞏膜、腫瘤組織、胃、腎臟等[8-10],其中皮膚組織作為疾病診斷和治療的靶向組織研究的較多。

    到目前為止,生物組織光透明研究大都考慮了光穿透深度隨滲透時間的變化,而忽略了OCA滲透過程中信號強度隨測量深度的空間分布。已知OCA向組織的擴散是一個漸變過程,相同深度的生物組織內OCA的濃度會隨著時間不斷增加;相同時刻,隨著深度的增加,濃度會逐漸減小。故對于不同深度,OCA的作用效果不同。本研究結果為了解OCA濃度及作用時間對于不同深度最優(yōu)選擇,提供了有價值的數據參考。證明了OCA濃度及作用時間對提高OCT圖像信號強度存在重要的相關性,進一步理解了OCA的作用機制,對于其在醫(yī)學方面的應用有一定的指導作用。

    2 光學相干層析成像系統(tǒng)與散射機理

    2.1 光學相干層析成像系統(tǒng)

    譜域OCT(Spectral Domain OCT,SD-OCT)于1995年由Fercher[11]等首次提出,如圖1所示,SD-OCT 系統(tǒng)由光源、邁克爾遜干涉儀、探測器等組成。參考光束被平面鏡反射并與樣品產生的背散射光在光纖耦合器內進行干涉,形成攜帶樣品內部信息的干涉光,之后聚焦到CCD相機上,實現干涉光譜信號的探測。

    圖1 頻域OCT系統(tǒng)原理圖Fig.1 The schematic of SD-OCT system

    假設生物組織的反射點是離散的,那么其反射率則可以表示為與深度有關的函數R(Δz),其

    中Δz為參考臂與樣品臂的光程差。根據低相干干涉理論,CCD上探測到的光譜信號可以用下式表示[12]:

    i(Δz)=AρF-1s(k)?[F-1DC+BF-1CC]

    (1)

    其中A、B為常數,ρ是探測器響應度,RR為參考鏡的反射率,F-1s(k)是光源電場振幅的傅里葉逆變換,k為波數,可以看出OCT信號強度與被測物體的反射率相關。

    2.2 光與生物組織的相互作用

    當一束光入射到生物組織上時,理論上會產生反射、吸收和散射這三個效應,可能會影響光束的傳播路徑,這三者之間的關系如圖2所示。

    圖2 光在組織中傳輸效應示意圖Fig.2 Schematic of the light transmission in tissue

    ①反射性質:

    反射光被探測器探測,形成i(k)。根據Fresnel公式,當光垂直入射時,反射系數可以表示為:

    (2)

    可以看出反射系數與物體折射率有關,根據公式(1)可知,改變物體折射率可以改變OCT信號強度。

    ②散射效應

    本次實驗所用的OCT系統(tǒng)光源中心波長為1300 nm,在此波長時,生物組織的吸收較低,散射成為限制光在組織中穿透深度的主要因素[12]。在單次散射模型中,散射對光強所造成的削弱與損失,可以用Lambert-Beer公式來近似描述[13]:

    i(z)=i0e-μsz

    (3)

    其中z表示待測位置距離光源的距離,i0是入射光的光強,μs是介質的散射系數。根據Mie散射理論[14],無相互作用顆粒系統(tǒng)的約化散射系數被定義為:

    (4)

    2.3 光學透明劑的作用機理

    目前組織光透明的作用機制主要包括以下三種假說[15-17]:

    ①無形成分與有形成分折射率匹配

    OCA首先從生物組織外部向細胞與細胞間隙中擴散,然后開始從細胞膜外部向細胞基質中不斷的擴散。此過程導致各物質間的折射率差異降低,組織的透明度被增強。

    ②失水效應

    OCA向生物組織及細胞內滲透的同時必然伴隨水分子的交換,因此組織和細胞內部折射率低的水逐漸排出,提高折射率匹配度。

    ③膠原蛋白結構改變

    OCA與膠原蛋白纖維相互作用,導致膠原蛋白可逆溶解,從而降低其折射率,提高折射率匹配程度。

    結合公式(4)可知折射率匹配是TOC技術的基本原理,加入OCA后,增加了折射率的匹配程度,使m→1。μs就變得越小,這使得光在生物組織中表現出較深的穿透深度。

    3 材料和方法

    3.1 樣品的制備:

    實驗中所有豬皮均密封以防止自然失水,后保存在4℃的環(huán)境下,在12小時內完成實驗。在實驗前把樣品置于常溫下15分鐘,使用清水清洗豬皮表面的污垢,然后進行實驗。每個樣品被切成面積為3.0 cm×3.0 cm的方塊,平均厚度為0.5 cm。選取PEG-400、PEG-200、甘油、丙二醇的四種溶液,分別與水配置成30~100%共8種不同比例的溶液用作OCA,每隔10分鐘就用OCT系統(tǒng)測量豬皮圖像,總共持續(xù)2小時,觀察OCA的滲透過程。

    3.2 OCT系統(tǒng)

    本次實驗使用的OCT系統(tǒng)是THORLABS的TELESTO,光源中心波長1300 nm,水溶液中理論成像深度為3.5 mm,軸向分辨率為5.5 μm,A掃描速率在5.5~91 kHz之間。

    4 分析與討論

    4.1 不同濃度透明劑作用下的圖像和一維信號

    通過對離體豬皮作用不同濃度與種類的OCA,并進行長時間觀察,可得多組OCT掃描圖像。其中PEG-400作用豬皮的圖像如圖3所示??梢钥闯鲭x體豬皮作用OCA后,隨著時間的增大成像深度均有所增加,濃度越高增強效果越強。但仔細觀察OCT圖像,在豬皮的淺層部位信號強度隨著時間的增大而降低,為了更好的理解這種現象需要對圖像進行進一步分析。

    圖3 不同濃度PEG-400作用豬皮的OCT圖像Fig.3 OCT images of porcine skin samples with different concentrations of PEG-400

    通過圖像識別算法識別豬皮表面,將OCT的所有A 掃描重新對準表面,重建出新的圖像。對重建后的OCT圖像所有A掃描進行平均,得到一維信號,以抑制斑點噪聲、減少偽影。就可以的得到如圖4這樣OCT信號強度隨深度的變化曲線,后續(xù)根據這樣的曲線進行分析。

    圖4 正常豬皮的一維OCT信號Fig.4 1-D OCT signal of normal porcine skin

    提取不同深度下的信號強度用來比較不同濃度OCA對豬皮透明效果的影響,以PEG-400為例,具體數據如圖5所示??梢钥闯觯煌疃萇CA作用效果不同:

    ①如圖5(a)所示,淺層皮膚0.2 mm處,高濃度情況下隨著時間增大信號強度減弱,低濃度的情況下信號變化較小。

    ②如圖5(b-d)所示,中層皮膚0.4~0.8 mm處,信號強度達到最大值之后開始下降,濃度越高變化幅度越大,最大值越大。

    ③如圖5(e-f)所示,深層皮膚的1.0~1.4 mm處,OCT信號強度一直在增加,濃度越高增加的越明顯。

    圖5 不同濃度PEG-400作用下不同深度豬皮信號強度變化。(a-f)表示0.2 mm,0.4 mm,0.6 mm,0.8 mm,1.0 mm,1.4 mm深度Fig.5 Intensity changes of porcine skin at different depths with different concentrations of PEG-400.(a-f) shows 0.2 mm, 0.4 mm, 0.6 mm, 0.8 mm, 1.0 mm, 1.4 mm depth

    根據文獻的結果表明,OCA向皮膚的擴散是一個漸變過程,不同深度的濃度不同。相同深度的皮膚內OCA濃度會隨著時間不斷增加;相同時刻,隨著深度的增加,OCA濃度會逐漸減小[18]。再結合第2節(jié)的討論可知,OCA作用皮膚時不僅會降低組織散射使光散射幾率減小,增強OCT信號強度,同時也會降低皮膚局部反射率致使信號強度降低。故OCT信號強度取決于光在傳播路徑中散射造成的衰減和觀測點的局部反射率兩個方面,由此可以得出以下幾點結論:

    ①淺層皮膚

    皮膚表面與測量位置的距離較短,光在傳輸路徑上的衰減對OCT圖像的影響較小,加入高折射率溶液后導致皮膚局部反射率降低使得淺層反射信號減小。高濃度溶液相比低濃度溶液擁有更大的折射率,從而使OCT信號強度降低得更快。

    ②中層皮膚

    皮膚表面與測量位置的距離較長,光在傳輸路徑上的衰減對OCT圖像的影響較大,因此降低衰減顯著增加了皮膚中層反射信號。但隨著滲透時間的增加,皮膚中層的OCA濃度增加,使得局部折射率增大反射率降低,又導致OCT信號強度降低。

    ③深層皮膚

    因為皮膚深度較深,其中OCA的濃度一直不高,使得OCT信號強度一直在增加。因高濃度溶液擁有更大的折射率能更加迅速的改變背景折射率,故OCA濃度越高增強效果越明顯。

    4.2 不同種類透明劑作用下信號強度對比

    為了更好的分析皮膚的內部結構與可能存在的病變,用OCA盡可能的提升OCT信號強度。把四種OCA作用下信號變化最大值提取出來進行比較(圖6),就可以分析不同OCA的作用效果。

    圖6 不同OCA作用下豬皮信號強度變化最大值Fig.6 Maximum intensity changes of porcine skin with different OCA

    現階段針對OCA的篩選,主要考慮高折射率與高滲透性的兩方面性質。高折射率溶液進入組織替換組織間液提高組織背景折射率,以及高滲性透溶液引起組織脫水,表1列出了四種試劑100%濃度情況下的折射率、分子量、以及羥基的數目。

    表1 不同醇的物理特性[17]Table.1 Characteristics of the different alcohols

    從上表的數據以及實驗結果可以得出以下幾點結論:

    ①三元醇的光透明效果好于二元醇

    Hirshburg[16]認為OCA中的羥基可以與膠原分子形成氫鍵,并取代水化膜中的水分子,破壞膠原纖維的高階散射結構。使得膠原纖維解離成為更小的膠原原纖維,降低膠原纖維的折射率,提高折射率匹配。如果醇有更多的羥基,水化膜的破壞就更大,因此,形成氫鍵橋的傾向被認為是光學透明效果的一個重要因素。

    ②折射率越大透明效果越好

    選擇的醇類試劑的折射率均高于皮膚,可以看出折射率越大透明效果越好,這是因為:一方面,高折射率溶液擁有更大的折射率能更加迅速的改變背景折射率;同時對于同一種溶液,高折射率相比低折射率擁有更大的濃度,從而能更快的滲透入皮膚中并且引起脫水。

    ③分子量不直接影響光透明效果

    因為小分子物質較易穿透皮膚,表明分子量可能會通過影響 OCA 在皮膚的穿透力而影響其光透明效果。然而結果表明分子量不直接影響光透明劑的作用效果,這可能是因為分子量并不是影響透明效應的唯一原因,多種機理共同作用造成了這樣的結果。

    ④淺層與深層位置透明效果相反

    根據第2節(jié)的分析,對于淺層皮膚,OCT信號強度主要取決于反射率的降低。根據反射理論可知,皮膚的折射率越大,局部反射率越小。折射率越高的試劑越能降低皮膚的反射率,也就形成了與深層皮膚透明效果相反的結果。

    6 結論

    本文將不同濃度與種類的OCA作用于離體豬皮,并用OCT進行2小時長時間觀察。定量分析其作用效果,比較不同時間段、不同OCA作用下的信號強度變化。發(fā)現不同濃度與種類的OCA均能有效的提高OCT的成像深度,并且濃度越高,透明效果越好。但皮膚不同深度的強度變化并不一致,所以想要觀察不同深度的組織結構或者病變,則需要選取適當的OCA與作用時間。

    該研究對提升OCT技術在生物醫(yī)學成像中能力,以及在將來的皮膚疾病診斷中,OCA種類及作用時間的選擇提供理論依據和數據參考。拓展了OCT成像技術在臨床皮膚病成像和診斷中應用能力,對于OCA在醫(yī)學方面的應用有一定的指導作用。但我們實驗中的OCA均作用于離體皮膚,對于在體皮膚是否會有相同效果還需要進一步的探索。

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