體外胰腺腺泡細胞炎性反應中ZFP580與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相互作用

資 力，劉廣林，張文成，夏時海，許 威

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常見的消化道急癥和重癥，發(fā)病機制主要包括消化酶的過早激活、炎性反應和腺泡細胞死亡。盡管既往相關(guān)研究已經(jīng)很多，但AP過程中腺泡細胞損傷的分子機制仍未完全闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER-stress，ERS)是一種以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯誤折疊蛋白的積累為特征的細胞功能障礙狀態(tài)。胰腺腺泡細胞作為消化酶的主要合成來源，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常豐富，使得腺泡細胞易受到AP過程中各種炎性反應因子的誘導，從而發(fā)生ERS。嚴重和持久的ERS會導致細胞內(nèi)活性氧增加，線粒體釋放更多的細胞色素C，并且誘導Caspase12介導的細胞凋亡并促進NF-κB介導的炎性反應，干擾體內(nèi)鈣調(diào)節(jié)通道，進而引起不可逆的細胞損傷。鋅指蛋白580(zinc finger protein 580，ZFP580)是由張文成教授克隆出的一種新發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合蛋白，前期研究結(jié)果表明ZFP580與胰腺纖維化、胰腺慢性炎性反應發(fā)生發(fā)展過程及IL-6、ROS、NF-κB等炎性因子之間有密切關(guān)聯(lián)，檢索GEO數(shù)據(jù)庫顯示人乳腺癌細胞系中ZFP580表達與未折疊蛋白反應下游效應因子Xbp-1s的表達呈現(xiàn)一定相關(guān)性，BGEE數(shù)據(jù)庫顯示經(jīng)基因測序ZFP580在鼠胰腺組織有表達。本研究以探索胰腺腺泡細胞炎性反應過程中，ZFP580與ERS相互作用的具體途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠AR42J購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，由武警特色醫(yī)學中心消化疾病研究所保種。RPMI1640培養(yǎng)液(美國Hyclone)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶)；胎牛血清FBS(美國Gibico)；DMSO(美國Sigma)；IRE1阻斷劑MKC-3946(美國Sigma)；6/12/24/96孔板(美國Thermo Fisher)；β-actin抗體(德國羅氏)；山羊抗兔熒光二抗(武漢Proteintech)；XBP-1s抗體(美國Abcam)；Chop抗體(沈陽萬類生物科技)；Caspase-3抗體(沈陽萬類生物科技)；ZFP580抗體(美國Abcam)；轉(zhuǎn)膜槽(美國Bio-Rad)；電泳儀(美國Bio-Rad)；7500實時熒光定量PCR儀(美國Appllied Biosystems)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取出存放的AR42J細胞，解凍后加入培養(yǎng)液，在設(shè)置好的孵育箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。待觀察皿內(nèi)細胞生長至基本飽和(密度90%以上)時，傳代以使細胞繼續(xù)生長。

1.2.2 細胞干預與分組 依照實驗需求，IRE1阻斷劑(MKC-3946)、慢病毒，蛙皮素在IRE1阻斷劑作用1 h后加入，根據(jù)處理方式分為普通對照組、單阻斷劑組、單蛙皮素刺激組、慢病毒轉(zhuǎn)染組、阻斷劑+蛙皮素刺激組及轉(zhuǎn)染+蛙皮素刺激組。

1.2.3 MTT法檢測蛙皮素作用時間對AR42J細胞活性影響 取AR42J細胞制成細胞懸液，按要求接種在96孔板內(nèi)，保留空白對照，余分別在0、4、8、12、16、20 h加入蛙皮素(終濃度為100 nM)，分別設(shè)置3個復孔，培養(yǎng)24 h后加入10 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔換成150 μl的二甲基亞砜，震蕩10 min后測定各孔的吸光值，根據(jù)結(jié)果計算IC。

1.2.4 RT-PCR檢測ZFP580 mRNA的表達 收取6孔板中AR42J細胞提取RNA并平衡濃度，反轉(zhuǎn)錄cDNA后檢測目的mRNA水平。

1.2.5 細胞總蛋白提取及Western-blot檢測 收取AR42J細胞，加入RIPA蛋白裂解液，離心，取上清液。BCA法測定各組蛋白濃度，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別加入β-actin、ZFP580、Xbp-1s、Caspase-3、Chop單克隆抗體作為一抗，4 ℃過夜，經(jīng)TBST緩沖液洗滌后加入HRP標記山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵育2 h，經(jīng)TBST緩沖液洗滌后，應用ECL發(fā)光法顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.2.6 慢病毒沉默ZFP580 取生長狀態(tài)良好的AR42J細胞按要求接種在6孔板內(nèi)。于各組加入4E+6TU的慢病毒lv-zfp580-RNAi (73469-1)、CON313以及4 μl的病毒感染試劑HitransG轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染完成后分別于各組加入2 μg /ml嘌呤霉素進行篩選(重復進行此步驟5次，以期轉(zhuǎn)染率達95%以上)。

1.2.7 Hochest33342染色檢測細胞凋亡情況 細胞處理后，加入Hochest固定液10 min，PBS沖洗2次，加入Hochest染色液0.5 ml孵育5 min，吸盡染色液后洗滌2次，而后封片置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 AR42J細胞炎性反應過程中ERS啟動 蛙皮素能誘導AR42J細胞炎性反應過程，以100 nM 蛙皮素刺激后提取RNA進行RT-PCR檢測以觀察炎性反應過程中ERS相關(guān)標志物的表達情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，ER-Stress標志物GRP78和效應因子XBP-1s從4 h開始升高，ZFP580由8 h開始升高，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，表1)，上述因子表達隨時間延長而逐漸增加。

2.2 蛙皮素作用時間對AR42J細胞活性影響 Cer造模時一般采用100 nM濃度，作用時間12～24 h。Cer對AR42J細胞活性的抑制呈時間依賴，為后續(xù)觀察細胞凋亡壞死結(jié)果，取細胞死亡一半的作用時間作為后續(xù)實驗的Cer干預時間，計算IC=19；即Cer濃度100 nM、作用19 h達到一個合適的平衡，得到實驗所需造模效果(圖1)。

2.3 應用IRE1抑制劑(MKC-3946)后ZFP580表達情況 對GEO數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)進行檢索后推測ZFP580可能位于UPR信號途徑之一的IRE1通路。使用IREI抑制劑(MKC-3946)抑制IRE1通路表達，RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，抑制劑組的ZFP580的表達受抑制；WB結(jié)果(圖2)與PCR結(jié)果類似，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，表2)，由此推測ZFP580與UPR反應相關(guān)聯(lián)，且位于IRE1下游。

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染AR42J細胞 以慢病毒轉(zhuǎn)染沉默ZFP580得到低表達AR42J細胞株。轉(zhuǎn)染后RT-PCR和WB(圖3)驗證，沉默組ZFP580表達明顯下降，提示轉(zhuǎn)染成功(<0.05，表3)。

2.5 沉默ZFP580對IRE1通路影響 為進一步明確ZFP580在IRE1通路中的位置，以Cer刺激AR42J造模，結(jié)果顯示：與對照組相比，低表達組XBP-1s的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，表4)。

2.6 沉默ZFP580對細胞凋亡-壞死的影響 以AR42J細胞經(jīng)Cer干預后，使用Hochest染色觀察細胞形態(tài)變化，從形態(tài)學結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)低表達組的壞死細胞比例要明顯高于普通AP組(圖4)。同時，WB法檢測相關(guān)凋亡蛋白Chop/Caspase-3的表達情況，結(jié)果顯示Cer刺激19 h后Chop的表達量，沉默ZFP580組要明顯高于普通AP組，而沉默ZFP580組中Caspase-3的表達要低于普通AP組(圖5)。證明沉默ZFP580后，AP過程中壞死比例增高，而Caspase-3與細胞凋亡相關(guān)，其表達下降證實凋亡比例相應降低。

3 討 論

ERS啟動后發(fā)生的未折疊蛋白反應(UPR)包含3條不同的信號途徑，分別是IRE1、ATF6和PERK。細胞受到炎性反應因子的誘導時，IRE1通路啟動，產(chǎn)生活性轉(zhuǎn)錄因子XBP-1s，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有關(guān)于蛋白質(zhì)折疊和降解的基因轉(zhuǎn)錄。針對沉默XBP-1動物模型的研究揭示了XBP-1在胰腺外分泌中的重要作用，缺乏XBP-1的小鼠表現(xiàn)出嚴重的胰腺外分泌功能不全，出生后不久即因消化功能不全、營養(yǎng)不良導致死亡。有研究顯示，與野生小鼠相比，沉默XBP-1小鼠ERS標志物GRP78/BIP以及UPR反應通路蛋白ATF6和PERK明顯升高，同時對腺泡細胞分化標記物檢測發(fā)現(xiàn)，其淀粉酶和彈性酶水平相較于野生小鼠降低了60%～70%。因此，IRE1/XBP-1這一信號通路對于胰腺腺泡細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及損傷后的恢復非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cer刺激的AR42J中，沉默ZFP580可降低XBP-1s的表達，并影響凋亡因子Caspase-3的反應水平，這提示了ZFP580可能通過調(diào)節(jié)腺泡細胞的凋亡水平來影響AP炎性反應的程度。

Rasheva等發(fā)現(xiàn)，GRP78/BIP水平的變化可預示細胞是否進入ERS狀態(tài)。由此猜測，ERS在胰腺炎初期即開始發(fā)揮作用。UPR反應重要的轉(zhuǎn)錄因子XBP-1s可調(diào)控ERS伴侶分子表達，在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)AR42J細胞發(fā)生ERS后ZFP580的表達出現(xiàn)顯著升高，ERS標志物GRP78和通路IRE1下游產(chǎn)物XBP-1s和凋亡相關(guān)因子Chop、Caspase-3的表達相繼增加，使用慢病毒下調(diào)ZFP580表達后，從PCR及WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)下游產(chǎn)物XBP-1s降低，而凋亡相關(guān)因子Caspase-3的表達也隨之下降。由此我們推測ZFP580在由蛙皮素誘導胰腺腺泡細胞引起的ERS中發(fā)揮了重要作用，且XBP-1s可能是ZFP580在ERS途徑中的一個作用靶點。

在AP進展過程中，胰腺腺泡細胞損傷是一個多因素介導的復雜生物學過程，最終導致細胞凋亡或壞死。腺泡細胞死亡是胰腺炎結(jié)局的一個重要影響指標。細胞凋亡和壞死是程序性死亡的不同形式，在維持哺乳動物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面扮演重要角色。細胞的凋亡和壞死與AP炎性反應的嚴重程度密切相關(guān)。目前隨著研究的深入，胰腺腺泡細胞損傷的新機制不斷被闡明。長期激活的ERS會導致腺泡細胞產(chǎn)生凋亡反應。Caspase活化已知有4種途徑:死亡受體途徑、線粒體途徑、顆粒酶B介導途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導途徑。大量研究發(fā)現(xiàn)，ERS后期通過調(diào)節(jié)細胞凋亡和壞死來加重胰腺腺泡細胞的炎性反應損傷，從而加速胰腺炎的病理過程。Chen等通過觀察急性水腫型和重型壞死性胰腺炎模型大鼠胰腺腺泡細胞死亡時發(fā)現(xiàn)，前者較后者凋亡指數(shù)高，壞死比例小。除了對腺泡細胞的研究，F(xiàn)onseca等發(fā)現(xiàn)ERS會影響胰島β細胞的功能甚至導致其死亡。ERS誘導的細胞凋亡可通過多種信號途徑實現(xiàn)，其中誘導細胞凋亡，而不是壞死或線粒體靶向性凋亡。而激活的XBP-1s可使JNK磷酸化，激活下游轉(zhuǎn)錄因子(如c-jun, c-fos和 Sap-1)并調(diào)節(jié)胞內(nèi)RNA穩(wěn)定性，影響細胞凋亡。

本研究通過Hochest染色發(fā)現(xiàn)，與對照AP組相比，沉默ZFP580組的壞死細胞比例明顯升高，這在WB結(jié)果(Chop表達量增加)中得到證實，同時Caspase-3的表達水平降低，證實凋亡比例下降。因此我們推測，體外實驗中ZFP580可能通過改善腺泡細胞炎性反應過程中的凋亡壞死比例，來實現(xiàn)其在AP進程中的保護作用。

總之，本研究通過體外研究發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡細胞通過ERS誘導了ZFP580表達，進而在促進腺泡細胞的凋亡同時減少壞死，進而減輕AP的嚴重程度，值得進一步研究。