不同ELISA 和AGID 試劑盒檢測馬傳染性貧血病毒抗體的比較

薛 文，秦 菊，努爾買買提·阿穆提，馬曉艷，蘇曉慧，阿依吐拉·肉孜，李雷斌，陳玲玲，古麗曼·木哈買提拜，王 文

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830011；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618；4.廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西南寧 530005）

馬傳染性貧血（equine infectious anemia，EIA），簡稱馬傳貧，是由馬傳染性貧血病毒（EIAV）引起馬屬動物的一種以反復(fù)發(fā)熱、貧血和持續(xù)病毒血癥為特征的傳染性疾病，我國將其列為二類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須通報動物疫病[1]。《馬傳染性貧血檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 2717—2010）規(guī)定EIAV 的實驗室檢測方法為病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）。AGID 方法簡便特異，是國際貿(mào)易中指定的診斷方法，但是瓊脂濃度及溫度會對瓊脂板質(zhì)量產(chǎn)生影響，同時技術(shù)人員的不當(dāng)操作也可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果[2-3]。相比之下，ELISA 方法簡單靈敏，適合樣本的高通量檢測，是EIAV 初篩的常用方法。

1963 年，新疆首次確診EIA 疫情，通過采取綜合性防制、檢疫凈化、免疫、全面檢疫凈化和達(dá)標(biāo)考核驗收等處置措施[4]，疫情得到有效控制。近年來，新疆各地傳統(tǒng)民族馬術(shù)活動和以馬術(shù)體育競賽、騎馬旅游、民族馬術(shù)演出為主題的節(jié)慶活動開展日益頻繁，做好EIA 的監(jiān)測與防控工作至關(guān)重要。2018 年開始，新疆全區(qū)推廣使用ELISA 方法初篩結(jié)合AGID 方法確診的方式開展EIAV 監(jiān)測，切實加快了EIA 的消滅進程。為了保障新疆現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，本試驗篩選了市面上4 種商品化ELISA 試劑盒和3 種AGID 試劑盒進行比對分析，旨在為選擇更有效的EIAV 檢測試劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 馬血清樣本

1 份EIAV 強陽性血清及28 份臨床馬血清，均為本實驗室集中監(jiān)測保留樣本，-20 ℃保存。

1.2 檢測試劑盒

ELISA 檢測試劑盒：A（批號P200601-004）、B（批號20200812-0031）、C（批號GS456）、D（批號G58）；AGID 檢測試劑盒：A（批號P200301-001）、B（批號20200402）、C（批號HR798）。

1.3 主要儀器

全波長酶標(biāo)儀，Multiscan GO/美國Thermo 公司；高速自動化洗板機，Hydrospeed/帝肯公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，DHP-9082PY/上海一恒科技有限公司；單道微量移液器，Brand 公司。

1.4 檢測方法

1.4.1 靈敏性試驗 用3 種商品化AGID 試劑盒和4 種ELISA 試劑盒分別檢測EIAV 強陽性血清，將被檢測血清從1:2 倍比稀釋至1:2 048，每個稀釋度做2 個重復(fù)。AGID 試劑盒檢測步驟依據(jù)《馬傳染性貧血病瓊脂凝膠免疫擴散試驗方法》（NY/T 569—2002）和試劑盒說明書進行。陽性對照參考線延伸到樣品孔，無彎曲或具有遠(yuǎn)離抗原孔并朝向陽性對照血清的略微彎曲，判定為陰性；陽性對照參考線與樣品和抗原之間的線連成一條連續(xù)的沉淀線，判定為強陽性；對照沉淀線跑入樣品孔，且出現(xiàn)彎曲、方向朝向中心抗原孔的沉淀線，但在樣品孔和抗原孔之間未形成連續(xù)的線，判定為弱陽性。ELISA 試劑盒具體操作步驟和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照相應(yīng)試劑盒說明書進行（表1）。

表1 4 種ELISA 試劑盒檢測原理和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 臨床樣品檢測 以28 份臨床馬血清作為樣品盤，分別用4 種商品化ELISA 試劑盒和AGID試劑盒B 進行抗體檢測，以AGID 結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，通過計算符合率、Kappa 值、敏感性、特異性和約登指數(shù)，綜合評價4 種ELISA 試劑盒的檢測效果。具體操作步驟和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同1.4.1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以AGID 試驗數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，計算4 種ELISA試劑盒的敏感性、特異性和符合率。敏感性=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%；符合率=（真陽性+真陰性）/樣本數(shù)量×100%。根據(jù)Kappa值評價試劑盒的一致性：Kappa 值＜0，代表一致性極差；0～0.2，代表一致性微弱；＞0.2～0.4，代表一致性弱；＞0.4～0.6，代表一致性中度；＞0.6～0.8，代表一致性高度；＞0.8～1.0，代表一致性極強。約登指數(shù)=敏感性+特異性-1。

2 結(jié)果

2.1 靈敏性試驗

A、B、C、D 4 種ELISA 檢測試劑盒呈陽性反應(yīng)的終點效價分別為1:1 024、1:256、1:32、1:128，A、B、C 3 種AGID 試劑盒呈陽性反應(yīng)的終點效價均為1:16（表2）。

表2 ELISA 方法和AGID 方法的靈敏性試驗結(jié)果

2.2 臨床樣品檢測

使用AGID 試劑盒B 和4 種ELISA 試劑盒分別對28 份田間馬血清進行檢測。結(jié)果（表3）顯示，ELISA 與AGID 檢測結(jié)果存在一定差異，且4 種ELISA 試劑盒檢測結(jié)果也不完全一致。28 份血清中，AGID 試劑盒B 檢測出陽性血清12 份，4 種ELISA 試劑盒分別檢測出陽性血清12、14、11、9 份。在AGID 試劑盒B 檢測出的12 份陽性血清中，ELISA 試劑盒A、B 的檢測結(jié)果也為陽性，試劑盒C 檢出1 份陰性，試劑盒D 檢出3 份陰性；在AGID試劑盒B檢測出的16份陰性血清中，ELISA 試劑盒A、C、D 的檢測結(jié)果也全部為陰性，僅試劑盒B 檢出2 份陽性。

表3 AGID 試劑盒B 與4 種ELISA 試劑盒檢測結(jié)果比較

2.3 4 種ELISA 試劑盒綜合評價

28 份田間馬血清的檢測結(jié)果（表4）顯示，ELISA 試劑盒A 與AGID 試劑盒B 檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%（28/28），其他3 種ELISA試劑盒與AGID 試劑盒B 的總體符合率分別為92.86%（26/28）、96.43%（27/28）、89.29%（25/28）。根據(jù)Kappa 一致性檢驗，4 種ELISA 試劑盒與AGID 試劑盒 的Kappa 值分別為1.000、0.857、0.926、0.774。

以AGID 結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，4 種ELISA 試劑盒的敏感性分別為100%（12/12）、100%（12/12）、91.67%（11/12）、75.00%（9/12），特異性分別為100%（16/16）、87.50%（14/16）、100%（16/16）、100%（16/16），約登指數(shù)分別為1.00、0.88、0.91、0.75。本試驗中ELISA 試劑盒B 的敏感性（100%）高于試劑盒C（91.70%），而特異性（87.50%）低于試劑盒C（100%），試劑盒的敏感性和特異性有差異，因而需要通過約登指數(shù)進行比較。對4種ELISA 試劑盒的約登指數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒A效果最佳，其他依次是試劑盒C、B、D（表4）。

表4 4 種ELISA 試劑盒綜合評價結(jié)果

3 討論

本研究的靈敏性試驗結(jié)果顯示，4 種ELISA試劑盒陽性反應(yīng)的終點效價分別為1:1 024、1:256、1:32、1:128，3 種AGID 法試劑盒均為1:16，說明ELISA 試劑盒的檢測靈敏度普遍高于AGID 試劑盒。郭振梅等[5]的試驗結(jié)果顯示，使用間接ELISA 方法檢測瓊脂擴散試驗陰性馬血清的復(fù)陽率為4.4%（29/649）。張德祿[6]使用間接ELISA 方法復(fù)檢340 份冷凍保存2 個月左右的瓊擴試驗陰性血清復(fù)陽率為45%（153/340）。以上結(jié)果提示，與AGID 方法相比，ELISA 方法提高了抗體滴度過低血清樣品的陽性檢出率。由于樣本數(shù)量限制，本試驗在樣品盤設(shè)置上，缺少弱陽性及陰性樣品，且未對試劑盒批內(nèi)及批間穩(wěn)定性進行評價，在實際應(yīng)用中有必要增加弱陽性樣品及陰性樣品，并對試劑盒的穩(wěn)定性進行評測。

本研究的一致性試驗結(jié)果顯示，4 種ELISA試劑盒與AGID 試劑盒檢測結(jié)果的符合率均能達(dá)到89%以上。王大孝等[7]使用ELISA 和AGID 對馬血清進行比較檢測發(fā)現(xiàn)，1 298 份健康馬血清符合率為100%（1298/1298），44 份感染馬血清符合率為95.45%（42/44）。康嘵杰[8]使用20 份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和268 份臨床馬血清進行雙抗原夾心ELISA 和AGID 比較試驗，符合率為98.96%，與本次試驗結(jié)果接近。根據(jù)Kappa 一致性檢驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，Kappa 值越大，代表結(jié)果可靠程度越高。本試驗中，ELISA 試劑盒A、B、C 與AGID 試劑盒一致性檢測結(jié)果均為極強，試劑盒D 與AGID試劑盒一致性檢測結(jié)果為高度。由此可見，ELISA是EIA 診斷的可靠手段之一。

在4 種ELISA 試劑盒中，試劑盒A、B 的敏感性均達(dá)到100%（12/12），優(yōu)于試劑盒C（91.67%）和試劑盒D（75.00%）；試劑盒A、C、D 的特異性均達(dá)到100%，優(yōu)于試劑盒B（87.50%）。試劑盒A 采用雙抗原夾心方法，使用純化的EIAV p26重組抗原和過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白p26 結(jié)合物作為雙抗原，有效減少了非特異性抗體干擾，從反應(yīng)機制上減少了假陽性，特異性較間接法（試劑盒D）和競爭法（B、C 試劑盒）都高。同時雙抗原夾心法檢測總抗體，可有效檢測弱陽性樣品[9]。

考慮到敏感性和特異性權(quán)重不同，本研究引入加權(quán)約登指數(shù)，加權(quán)約登指數(shù)Jω=2×[ω×靈敏性+(1-ω)×特異性]-1（ω為權(quán)重，0 ≤ω≤1）；0 ≤Jω≤1，Jω越接近1，代表真實性越大[10]。在EIA 凈化早期，預(yù)期流行率較高，應(yīng)盡可能篩選出可疑樣品，即更關(guān)注敏感性，那么可設(shè)定ω＞0.5，隨著ω增大，ELISA 試劑盒B的優(yōu)勢相對明顯；當(dāng)處于凈化晚期，預(yù)期流行率很低，應(yīng)避免誤殺造成的經(jīng)濟損失，即更關(guān)注特異性，那么可設(shè)定ω＜0.5，則ELISA 試劑盒C、D 的優(yōu)勢愈加明顯。以上結(jié)果提示，在開展EIAV 抗體監(jiān)測時，應(yīng)該根據(jù)實際情況合理選擇試劑盒，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前，監(jiān)測篩查EIAV 陽性血清通常使用垂直試驗，即經(jīng)ELISA 初篩的陽性血清必須通過AGID 試驗確認(rèn)[11]。這種聯(lián)合試驗方法可以使兩種方法優(yōu)勢互補，有效提高試驗的特異性和陽性預(yù)測值，提升檢測可靠性，縮短疫區(qū)凈化時間。當(dāng)ELISA、AGID 的檢測結(jié)果不一致時，需要反復(fù)檢測或者使用免疫印跡法進行修正[3]。