廈門市寵物犬貓中布魯氏菌、弓形蟲、A 型流感病毒及巴爾通體的流行病學調(diào)查

趙 冉，蔡振鴻，陳 瓊，陳永鋒，連玉華，夏馥麗，徐 麗

（1.廈門市動物疫病預防控制中心，福建廈門 361009；2.廈門市思明區(qū)市政中心，福建廈門 361005）

布魯氏菌、剛地弓形蟲、A 型流感病毒及巴爾通體是重要的人獸共患病病原。布魯氏菌主要引起感染動物生殖器官炎癥及繁殖障礙。犬貓不僅可感染粗糙型犬種布魯氏菌，亦可感染光滑型羊種、牛種和豬種布魯氏菌[1-2]。弓形蟲主要引起感染動物眼病、肝病、肺炎、心包心肌炎和流產(chǎn)[3-4]。貓既是弓形蟲的終末宿主，又是中間宿主。動物感染A 型流感病毒后以打噴嚏、咳嗽、發(fā)熱及呼吸困難為主要癥狀，已證實H3N8、H3N2、H5N1、H5N2、H1N1、H9N2、H10N8 和H6N1 等亞型均可感染犬貓[5-8]。巴爾通體主要引發(fā)菌血癥、淋巴結(jié)炎癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肝炎、脾炎、關(guān)節(jié)炎以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，在犬貓中已檢出漢賽巴爾通體、克氏巴爾通體、文森巴爾通體伯格霍夫亞種等多種巴爾通體[9-11]。

隨著城市化發(fā)展，廈門市寵物犬貓飼養(yǎng)量與日俱增。犬貓作為伴侶動物常與免疫力低下的兒童、孕婦及老年人密切接觸，且又是布魯氏菌、弓形蟲、流感病毒、巴爾通體等人獸共患病病原的易感動物，存在感染并傳染人的風險，具有潛在的公共衛(wèi)生隱患。本研究采集廈門市寵物犬貓樣品進行上述4 種人獸共患病病原檢測，旨在初步了解其在本地寵物犬貓中的流行現(xiàn)狀，從而為本地人獸共患病防治及公共衛(wèi)生安全保障提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 目標群體

本研究以廈門市動物診療機構(gòu)接診的寵物犬貓為目標群體。

1.2 樣品采集

2021 年10—11 月，遵循流行病學調(diào)查抽樣原則，采用先抽群體再抽個體的策略，從廈門市備案的70 家動物診療機構(gòu)中，隨機抽取35 家，每家抽取5 只犬和5 只貓。按便利抽樣原則，每家診療機構(gòu)從準備抽樣開始計算，接診的前5 只犬或貓作為樣本，不同年齡、不同性別，以及圈養(yǎng)與放養(yǎng)、臨床健康狀況等均為隨機抽樣。在征得主人同意的情況下進行樣品采集，每只犬貓對應(yīng)采集1 份血液及1 份抗凝全血，均為3～5 mL。血液置4 ℃冰箱過夜后分離血清用于抗體檢測，抗凝全血直接用于核酸檢測。

1.3 主要儀器

熒光定量PCR 儀，型號 QuantStudio 6 Flex，美國ABI 公司產(chǎn)品；小型臺式冷凍離心機，型號MIKRO 220R，德國HETTICH 公司產(chǎn)品；核酸提取儀，型號 KINGFISHER，Thermo 公司產(chǎn)品；自動洗板機，型號Hydroflex，瑞士TECAN 公司產(chǎn)品；酶標儀，型號iMark，美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品。

1.4 主要試劑

Premix ExTaqTM（Probe qPCR），購自大連寶生物；核酸提取試劑，購自南京中科拜爾公司；引物、探針及陽性質(zhì)粒序列（表1），均由生工生物公司合成；禽流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑，購自青島立見生物技術(shù)有限公司；犬種布魯氏菌IELISA 抗體檢測試劑，購自哈爾濱平河試劑公司；A 型流感病毒抗體檢測試劑（IDEXX）及弓形蟲ELISA 抗體檢測試劑盒（ID.vet），購自福州默沙東公司；禽流感H5 亞型（Re-11/Re-12 株）、H7亞型（Re-3 株）、H9 亞型血凝抑制試驗抗原及陰陽血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.5 檢測方法

1.5.1 抗體檢測 本研究選用的布魯氏菌檢測試劑可同時檢測平滑型及粗糙型布魯氏菌抗體，敏感性（Se）為99.5%，特異性（Sp）為99.0%；弓形蟲試劑的陽性血清判讀，按S/P≥70%計算，敏感性（Se）為95.0%，特異性（Sp）為98.0%；A型流感病毒ELISA 試劑敏感性（Se）為95.3%，特異性（Sp）為99.6%。A 型流感病毒H5、H7、H9 亞型抗體檢測，按血凝抑制試驗（國標法）進行，抗體滴度≥4log2 判為陽性。

1.5.2 核酸檢測 犬貓A 型流感病毒核酸檢測，參照試劑盒說明書進行。布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體的核酸檢測，應(yīng)用廈門市動物疫病預防控制中心實驗室建立的布魯氏菌、弓形蟲及巴爾通體三重熒光PCR 法進行，其敏感性（Se）為99.0%，特異性（Sp）為99.5%（文章待發(fā)表）?？偡磻?yīng)體系20.0 μL：2×Premix ExTaqTM（Probe qPCR）10.0 μL，BF、BR 各0.5 μL，BP 1.0 μL；GF、GR 各0.7 μL，GP 1.4 μL，SF、SR 各0.3 μL，SP 0.6 μL，待檢核酸4.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、58 ℃ 60 s，40 個循環(huán)，58 ℃時進行FAM、ROX 和JOE 三個通道的熒光信號搜集。結(jié)果判定：Ct 小于35，判為陽性；Ct 大于40，判為陰性；介于兩者之間判為可疑，進行重復試驗，如結(jié)果一致且有明顯的對數(shù)增長曲線，判為陽性。

1.6 病例定義

陽性樣品（個體）：布魯氏菌、弓形蟲、A型流感病毒檢測采用平行試驗策略，即樣品中無論抗體陽性還是核酸陽性，均判為陽性個體。巴爾通體核酸陽性定義為巴爾通體陽性個體。

1.7 流行率估計

表觀流行率（AP）：AP=陽性樣品數(shù)/抽檢樣品數(shù)。

真實流行率（TP）：TP=（AP+Sp-1）/（Se+Sp-1）。式中：Se 為布魯氏菌、弓形蟲、A型流感病毒平行試驗的敏感性，均為100%，巴爾通體為熒光PCR 試驗的敏感性；Sp 為布魯氏菌、弓形蟲、A 型流感病毒平行試驗的特異性，分別為98.5%、97.5%和99.1%，巴爾通體為熒光PCR 試驗的特異性。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集

原計劃從備案的70 家寵物診療機構(gòu)中抽檢35家寵物診療機構(gòu)，因受疫情影響，實際僅完成32家的樣品采集。計劃每家隨機抽取5 只犬和5 只貓，實際共抽取304 只犬貓，其中犬172 只、貓132 只。共收集到犬貓全血及抗凝全血各304 份。經(jīng)詢問，所采集的304 只犬貓均無布魯氏菌、弓形蟲、流感病毒及巴爾通體免疫背景。

2.2 血清學檢測

304 份犬貓血清中，共檢出6 份布魯氏菌抗體陽性，表觀流行率為2.0%，真實流行率為0.5%（95%CI：0～1.3%）。其中：檢出犬陽性4 份，陽性率為2.3%；貓陽性2 份，陽性率為1.5%。

共檢出10 份弓形蟲抗體陽性，表觀流行率 為3.3%，真實流行率為0.8%（95%CI：0～1.8%）。其中：檢出犬陽性5 份，陽性率為3.0%；貓陽性5 份，陽性率為3.8%。

共檢出26 份A 型流感病毒抗體，表觀流行率為8.6%，真實流行率7.7%（95%CI：4.7%～10.7%。其中檢出犬陽性23 份，陽性率為13.4%；檢出貓陽性3 份，陽性率為2.3%；檢出H9 亞型抗體陽性19 份，抗體滴度為4log2～6log2，未檢出H5 亞型及H7 亞型抗體陽性（抗體滴度＜1log2）。

4 份犬血清樣品中，同時檢出A 型流感病毒及布魯氏菌抗體陽性。

2.3 核酸檢測

304 份犬貓全血中均未檢出布魯氏菌、弓形蟲、巴爾通體及A 型流感病毒核酸。

3 討論

廈門市寵物犬貓的人獸共患病研究尚在起步階段，未見布魯氏菌、流感病毒及巴爾通體的流行病學報道。此次調(diào)查彌補了該領(lǐng)域的空白，為本地寵物人獸共患病防控提供了參考。巴爾通體為新發(fā)病病原，至少有30 多個種或亞種。A 型流感病毒血清型較多，其中H5、H7 亞型具有高致病性，可以感染人。另外，本地家禽中的H9 亞型檢出率也較高[15-16]，且該亞型亦可感染人，因此對A 型流感病毒抗體的陽性樣品進行了H5、H7、H9 亞型的分型鑒定。

4 種病原的真實流行率由高到低依次為A 型流感病毒（7.7%）、弓形蟲（0.8%）、布魯氏菌（0.5%）、巴爾通體（0），表明A 型流感病毒的傳播風險較高，但未檢出高致病性的H5 和H7 亞型。流感病毒抗體檢測數(shù)據(jù)顯示，寵物犬抗體陽性率為13.4%，遠高于寵物貓（2.3%）。寵物犬貓H9 亞型陽性率占總陽性的73.1%，未檢測到高致性H5 及H7 亞型抗體。近幾年對H9 亞型的研究[15-16]表明，該亞型有感染人發(fā)病且毒力增強的趨勢。本地犬貓中H9亞型檢出率較高，提示其存在潛在感染人的風險。

本地寵物犬貓中弓形蟲抗體陽性率分別是3.0%和3.8%，與2018—2019 年福州市犬（4.14%）、貓（2.71%）的弓形蟲抗體陽性率以及2019—2020廈門市寵物犬（4.68%）、貓（4.71%）的弓形蟲抗體陽性率接近，說明本地犬貓造成弓形蟲地方性流行的可能性較低，但由于存在感染人的潛在風險，建議持續(xù)監(jiān)測。

粗糙型布魯氏菌和光滑型布魯氏菌均可感染人，粗糙型致病性高于光滑型。本研究檢測的布魯氏菌抗體包括粗糙型和光滑型，表觀流行率為2.0%，真實流行率為0.5%，流行率較低。這與廈門城市化發(fā)展和生活質(zhì)量的改善密切相關(guān)。本地寵物犬貓多圈養(yǎng)于家中，較少與豬牛羊等家畜接觸，且多飼喂貓糧、狗糧等成品飼料，食生肉感染的概率不高。

近幾年北京、上海、山東等地的犬貓血液中先后檢出巴爾通體[9-11，13-14]，福建省在鼠中檢出巴爾通體[12]，在廈門市海滄區(qū)人群中亦檢出巴爾通體[2]，因此有必要對當?shù)貙櫸锶堖M行該病原的檢測。本次抽檢的304 份寵物犬貓血液中均未檢出巴爾通體陽性核酸，提示目前本地寵物犬貓中此種病原的感染率不高。但巴爾通體在鼠類中的檢出率較高，因此不能排除本地流浪犬貓感染或攜帶巴爾通體的可能。因此，應(yīng)避免人或者家養(yǎng)犬貓與流浪犬貓接觸，切斷傳播途徑，防止該病的發(fā)生與傳播。

本調(diào)查覆蓋全市46%的寵物診療機構(gòu)，完成304 只犬貓的初步流行病學調(diào)查，調(diào)查結(jié)果在一定程度上反映了2021 年廈門市寵物犬貓中這4 種病原的感染情況，雖未檢測到核酸，但證實寵物犬貓中存在流感病毒、弓形蟲及布魯氏菌陽性抗體，因此需引起畜主及防控機構(gòu)的重視。

今后應(yīng)繼續(xù)加強寵物中這4 種病原的監(jiān)測，同時加大防控宣傳力度，提高寵物飼養(yǎng)者的認知水平，提升個人防護意識，做好犬貓的飼養(yǎng)管理、糞便處理、犬貓舍清洗消毒，以降低寵物疾病的發(fā)生和潛在感染人的風險。