重組羊痘病毒P32 蛋白的真核表達(dá)與間接ELISA 檢測(cè)方法的建立

王健春，郭 宇，薩茹拉，高登軍，劉占喜，曹際娟，葛忠源，李雷斌，孫 雨

（1.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；3.大連民族大學(xué)，遼寧大連 116600；4.中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責(zé)任公司，北京 102600；5.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；6.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

山羊痘和綿羊痘統(tǒng)稱羊痘，分別由山羊痘病毒（goatpox virus，GPV）和綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPV）引起。GPV 和SPV 均屬于痘病毒科（Poxviridae）脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）山羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）[1-2]。我國(guó)在新修訂的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中將其列為二類動(dòng)物疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列入須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄。感染動(dòng)物表現(xiàn)為發(fā)熱，皮膚、黏膜、器官表面廣泛性丘疹或結(jié)節(jié)，皮膚水腫，淋巴結(jié)腫大，消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴(yán)重時(shí)死亡。羊痘給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大危害，嚴(yán)重阻礙國(guó)際貿(mào)易開(kāi)展。山羊痘最早于公元前200 年在歐洲被發(fā)現(xiàn)，綿羊痘最早于13 世紀(jì)在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)。羊痘是動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的一種，一般發(fā)病率為50%～80%，病死率20%～80%，其中對(duì)羔羊的致死率可達(dá)100%[2]。世界各地均有羊痘發(fā)病和流行的相關(guān)報(bào)道，目前在中東地區(qū)流行較為嚴(yán)重[1]。羊痘可通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物機(jī)械性接觸傳播，蚊子、蒼蠅和蜱等均可能是疫情跨地域遠(yuǎn)距離擴(kuò)散的“幫兇”，這無(wú)疑加大了羊痘的防治難度[3-4]。

P32 抗原是CaPV 的特有結(jié)構(gòu)蛋白，由痘病毒的H3L同源基因所編碼，是位于病毒膜表面的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白。P32 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為32 ku，位于CaPV 基因組的64～65 kb 處，由第74號(hào)ORF 編碼，具有多個(gè)抗原決定簇和B 細(xì)胞抗原表位[5]。動(dòng)物感染CaPV 后，在感染早期先產(chǎn)生針對(duì)P32 蛋白的中和抗體，然后才產(chǎn)生針對(duì)其他結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。P32 蛋白是所有CaPV 分離株共有的，特異性高、免疫原性強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白[4-6]。為獲得在Sf9 細(xì)胞中高效表達(dá)的P32 蛋白，本研究將編碼CaPV P32 抗原的核苷酸序列優(yōu)化為適合在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的偏好密碼子，去除氨基酸序列跨膜區(qū)，利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)純化、制備出了重組CaPV P32 蛋白，并建立了檢測(cè)CaPV 抗體的間接ELISA（Indirect-ELISA，I-ELISA）方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞、DH10Bac 感受態(tài)大腸桿菌、CaPV-P32 pFastBacHTA 質(zhì)粒，由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 主要試劑

SF900 II SFM 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基、Cellfectin?II Reagen 轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；2×PCR mix buffer、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、Plasmid Mini Kit，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；慶大霉素、氨芐青霉素、X-gal、四環(huán)素、IPTG、6×His mAb、家兔抗山羊IgGHRP，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒、鎳瓊脂糖凝膠，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒設(shè)計(jì)與構(gòu)建

利用SignalIP、TMHMM 跨膜區(qū)預(yù)測(cè)系統(tǒng)、GeneBank、DNAMan 和GenScript 等分子生物學(xué)軟件，分析并預(yù)測(cè)了經(jīng)典CaPV（Genbank 登錄號(hào)AFH08294.1）P32 的跨膜區(qū)序列、疏水區(qū)序列和稀有密碼子。優(yōu)化稀有密碼子為Sf9 細(xì)胞偏好的真核表達(dá)密碼子，并合成P32 蛋白編碼基因核苷酸序列；將合成的核苷酸序列轉(zhuǎn)至pFastBacHTA 重組載體中，構(gòu)建CaPV-P32-pFastBacHTA 重組質(zhì)粒；使用DNAMan 軟件設(shè)計(jì)P32 蛋白編碼基因擴(kuò)增引物CaPV-P32-F 和CaPV-P32-R（表1），由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 P32 蛋白編碼基因引物與M13 通用引物序列信息

1.4 重組質(zhì)粒PCR 擴(kuò)增與鑒定

分別使用合成的CaPV-P32-F/CaPV-P32-R為上下游引物，以重組構(gòu)建的質(zhì)粒CaPV-P32-pFastBacHTA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.5 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建與藍(lán)白斑篩選

使用LB 平板培養(yǎng)基（50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四環(huán)素，7 μg/mL 慶大霉素、40 mg/L IPTG、100 mg/L X-GAL）。提取重組質(zhì)粒CaPVP32-pFastBacHTA 并轉(zhuǎn)化至DH10Bac 細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，劃線接種至LB 平板培養(yǎng)基中，37 ℃條件下避光培養(yǎng)48 h，挑取培養(yǎng)基中的白色菌落。將提取轉(zhuǎn)座后的質(zhì)粒，以1.3 中構(gòu)建的CaPV-P32 上、下游引物擴(kuò)增驗(yàn)證CaPV-P32-pFastBacHTA 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座情況，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.6 包裝重組桿粒病毒并傳代

制備Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞，將密度為2×106的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞貼壁后，按照Bac-to-Bac 轉(zhuǎn)座重組技術(shù)，將篩選白斑提取質(zhì)粒后的Bacmid-CaPV-P32 轉(zhuǎn)染至Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞中，28 ℃條件下，培養(yǎng)96 h；將培養(yǎng)的細(xì)胞反復(fù)凍溶3 次，離心后取上清液體凍存，記為P1 代病毒；從P2 代病毒開(kāi)始，每代病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)72 h，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入2 mL 的不含雙抗的SF900 II 型細(xì)胞培養(yǎng)基；按照MOI 值為5 的標(biāo)準(zhǔn)傳代接毒細(xì)胞，傳至P5 代后反復(fù)凍溶離心區(qū)，取上清作為種毒備用，-80 ℃保存。

1.7 重組目的蛋白表達(dá)與鑒定

將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞后進(jìn)行重組目的蛋白表達(dá)與鑒定。在收集培養(yǎng)的細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液，4 ℃條件下靜置30 min；使用超聲破碎儀超聲破碎10 min，使用離心機(jī)4 ℃條件下，12 000 r/min 離心12 min；將離心后的上清液過(guò)濾后，使用Ni-Berpharose FF 純化試劑盒，對(duì)蛋白進(jìn)行初步粗純化，用SDS-PAGE 電泳觀察蛋白條帶；根據(jù)蛋白條帶的分子量大小、電泳后蛋白條帶清晰度、電泳背景等情況，初步分析粗提蛋白的表達(dá)量以及蛋白純度，并使用Nanodrop 和BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)粗提蛋白濃度。

1.8 重組蛋白AKTA 系統(tǒng)高效純化

粗提后的大量重組蛋白需要通過(guò)AKTA 系統(tǒng)進(jìn)行高效純化。使用高壓泵將細(xì)菌破碎后，以16 000 r/min、4℃條件高速離心40 min，收集上清液體，用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾；將預(yù)裝的鎳柱連入AKTA 系統(tǒng)，使用20 mmol/L Tris、150 mmol/L Nacl，pH7.2 的緩沖液平衡預(yù)裝鎳柱；將過(guò)濾好的上清液體通過(guò)上樣環(huán)上樣進(jìn)入AKTA 系統(tǒng)，使用20 個(gè)柱體積的含有50 mmol/L 咪唑溶液的雜質(zhì)洗滌液清洗鎳柱中的雜蛋白，用濃度為500 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液收集目的蛋白；將收集后的目的蛋白上樣AKTA 系統(tǒng)的分子篩，對(duì)粗純后的蛋白進(jìn)行精細(xì)純化。

1.9 P32 抗體間接ELISA 檢測(cè)方法建立與優(yōu)化

1.9.1 基本檢測(cè)條件建立與優(yōu)化 將AKTA 精細(xì)純化后的抗原進(jìn)行梯度稀釋并包被于ELISA 酶標(biāo)板中，按照棋盤(pán)滴定法確定包被抗原的最優(yōu)包被濃度與血清稀釋度；將牛血清白蛋白（BSA）封閉液，按照不同濃度稀釋后封閉ELISA 酶標(biāo)板，確定最優(yōu)封閉濃度；使用棋盤(pán)滴定交叉方法確定待檢血清與酶標(biāo)二抗的最佳稀釋濃度與作用時(shí)間；計(jì)算陽(yáng)性樣本與陰性樣本的P/N值，以P/N最大值所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)條件作為P32 抗體間接ELISA 檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件。

1.9.2 Cut-off臨界值確定 使用本研究建立的CaPV-P32 ELISA 抗體檢測(cè)方法，對(duì)經(jīng)血清抗體中和試驗(yàn)鑒定的350 份臨床陰性羊血清進(jìn)行檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)分析相應(yīng)的血清抗體OD450值，使用SPSS 軟件計(jì)算血清抗體的平均OD450值及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值（SD）。Cut-off臨界值確定：當(dāng)OD450＞＋4SD 判為陽(yáng)性，OD450＜＋4SD 時(shí)判為陰性。

1.9.3 特異性檢測(cè) 使用小反芻獸疫病毒抗體陽(yáng)性血清、羊O 型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性血清、羊A型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性血清、山羊關(guān)節(jié)炎與腦炎病毒抗體陽(yáng)性血清、綿羊梅迪維斯納病毒抗體陽(yáng)性血清、羊口瘡病毒抗體陽(yáng)性血清，對(duì)本研究建立的間接ELISA 方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證，根據(jù)檢測(cè)的OD450值與Cut-off臨界值來(lái)判定建立的檢測(cè)方法與其他羊病毒是否有非特異性交叉反應(yīng)。

1.9.4 敏感性檢測(cè) 使用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法，對(duì)購(gòu)自英國(guó)WOAH 參考實(shí)驗(yàn)室的CaPV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽(yáng)性血清（血清中和效價(jià)為1:512）進(jìn)行檢測(cè)。將CaPV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽(yáng)性血清從1:8 的稀釋度開(kāi)始倍比稀釋后檢測(cè)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果得出陽(yáng)性臨界值時(shí)的最大血清稀釋度。計(jì)算結(jié)果同血清中和試驗(yàn)的中和效價(jià)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.9.5 重復(fù)性檢測(cè) 使用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法，將10 份不同中和抗體效價(jià)的CaPV 抗體陽(yáng)性血清，分別在同批次（批內(nèi)）和不同批次（批間）的酶標(biāo)板上進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，每個(gè)試驗(yàn)平行驗(yàn)證5次，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

1.9.6 臨床血清樣品檢測(cè) 用建立的間接ELISA檢測(cè)方法結(jié)合血清中和試驗(yàn)，對(duì)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）保存的480份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算敏感性符合率、特異性符合率以及總符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaPV-P32-pFastBacHTA 重組質(zhì)粒構(gòu)建

使用特異性引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物片段（354 bp）。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物與目的基因片段相符，表明成功構(gòu)建了CaPV-P32-pFastBacHTA 重組質(zhì)粒。

2.2 重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-CaPV-P32 PCR 擴(kuò)增

將提取后的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒Bacmid-CaPV-P32 使用PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，得到與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物片段；測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果（圖3）顯示，轉(zhuǎn)座后陽(yáng)性質(zhì)粒與目的基因片段相符，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 Bacmid-CaPV-P32 致細(xì)胞病變結(jié)果觀察

在顯微鏡下觀察P5 代次的Bacmid-CaPV-P32桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)未感染組的Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)良好，而桿狀病毒Bacmid-CaPV-P32 感染組Sf9 細(xì)胞發(fā)生了明顯的增殖抑制，細(xì)胞聚攏呈拉鏈狀，細(xì)胞變圓、變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒及雜質(zhì)等細(xì)胞病變（圖4）。

2.4 不同代次桿狀病毒目的基因檢測(cè)

使用桿狀病毒的CaPV-P32-F/CaPV-P32-R 為上、下游引物，對(duì)P3、P4、P5 代重組桿狀病毒感染的Sf9 細(xì)胞，提取基因組進(jìn)行目的基因片段的PCR 擴(kuò)增，以檢測(cè)各代次病毒DNA 序列中是否包含P32 序列片段。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P32 蛋白編碼基因目的序列已成功與桿狀病毒基因組發(fā)生整合，并持續(xù)存在于各代次的病毒基因組中（圖5）。

2.5 重組蛋白表達(dá)與Western Blot 鑒定

將純化后的重組CaPV-P32 蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色液脫色后，獲得了大小約32 ku 且純度較高的重組CaPV-P32 蛋白（圖6）。SDS-PAGE 電泳后，對(duì)純化后的重組CaPV-P32 蛋白通過(guò)Western Blot試驗(yàn)鑒定反應(yīng)原性。Western Blot 結(jié)果顯示，重組CaPV-P32 蛋白在PVDF 轉(zhuǎn)印膜上顯示出相對(duì)分子質(zhì)量約為32 ku 的目的條帶（圖7），顯示了重組CaPV-P32 蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

2.6 CaPV-P32 間接ELISA 檢測(cè)方法建立與優(yōu)化

2.6.1 蛋白最佳包被濃度、一抗血清稀釋度與二抗稀釋度優(yōu)化 經(jīng)對(duì)包被蛋白CaPV-P32 濃度及一抗血清稀釋度試驗(yàn)驗(yàn)證，在CaPV-P32 抗原濃度1 μg/mL、4 ℃條件下作用18 h，3%BSA、4 ℃條件下封閉24 h，一抗血清稀釋度1:50，反應(yīng)45 min 時(shí)，計(jì)算得出的P/N值最大；當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋度為1:30 000，37 ℃條件下反應(yīng)45 min，底物反應(yīng)10 min 時(shí)，P/N值最高。

2.6.2 陰陽(yáng)性臨界值（Cut-off值）確定 使用本研究建立的CaPV-P32 ELISA 抗體檢測(cè)方法，對(duì)經(jīng)血清抗體中和試驗(yàn)鑒定的350 份臨床陰性羊血清進(jìn)行檢測(cè)，得到OD450平均值（X）為0.130，SD 為0.051，Cut-off值為X+4SD=0.334。

2.7 ELISA 檢測(cè)方法指標(biāo)驗(yàn)證

2.7.1 特異性 使用建立的CaPV-P32 ELISA 抗體檢測(cè)方法分別檢測(cè)了小反芻獸疫病毒抗體陽(yáng)性血清、羊O 型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性血清、羊A 型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性血清、山羊關(guān)節(jié)炎與腦炎病毒抗體陽(yáng)性血清、綿羊梅迪維斯納病毒抗體陽(yáng)性血清、羊口瘡病毒抗體陽(yáng)性血清，檢測(cè)得到的OD450值分別 為0.090、0.105、0.077、0.082、0.112、0.107，均小于Cut-off值0.334，說(shuō)明重組CaPV-P32 抗原對(duì)上述羊病毒的抗體陽(yáng)性血清無(wú)非特異性交叉反應(yīng)，所建立的方法特異性較好。

2.7.2 敏感性 使用建立的CaPV-P32 ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)購(gòu)買(mǎi)自英國(guó)WOAH 參考實(shí)驗(yàn)室的CaPV 標(biāo)準(zhǔn)抗體陽(yáng)性血清（血清中和效價(jià)為1:512）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)稀釋度在1:1 024 倍時(shí)仍為陽(yáng)性，表明建立的ELISA 檢測(cè)方法具有較高的敏感性，高于傳統(tǒng)的血清中和試驗(yàn)。

2.7.3 重復(fù)性 使用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法將10 份不同中和抗體效價(jià)的CaPV 抗體陽(yáng)性血清分別在批內(nèi)和批間的酶標(biāo)板上進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)批內(nèi)檢測(cè)的重復(fù)性變異系數(shù)與批間重復(fù)性變異系數(shù)指標(biāo)均小于10%（表2），表明所建立的ELISA檢測(cè)方法變異較小、重復(fù)性好、抗原穩(wěn)定性較高，可用于不同抗體效價(jià)樣本不同批次的CaPV 抗體檢測(cè)。

表2 間接ELISA 檢測(cè)方法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.7.4 臨床樣品測(cè)試 使用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法對(duì)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）保存的480 份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣本陽(yáng)性率為67.50%，而用羊痘病毒血清中和試驗(yàn)檢測(cè)的樣本陽(yáng)性率為68.75%，兩種方法的敏感性符合率為98.18%；用ELISA 方法檢測(cè)的樣本陰性率為29.17%，而羊痘病毒血清中和試驗(yàn)檢測(cè)的樣本陰性率為31.25%，兩種方法的特異性符合率為93.33%。兩種方法的總符合率為96.67%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 臨床血清樣品的對(duì)比測(cè)試結(jié)果 單位：份

3 討論

羊痘目前尚無(wú)有效藥物治療方法，對(duì)其防控國(guó)內(nèi)外主要采取疫苗免疫、病原與抗體監(jiān)測(cè)、種群凈化等綜合措施，因此疫苗免疫后的中和抗體監(jiān)測(cè)與疫苗免疫效果評(píng)價(jià)尤為重要。針對(duì)羊痘診斷，WOAH 陸生動(dòng)物手冊(cè)（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals）3.8.12 章羊痘診斷方法中涉及電鏡觀察、病毒分離、常規(guī)PCR檢測(cè)、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光抗體檢測(cè)等。國(guó)內(nèi)現(xiàn)行行標(biāo)《綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)》（NY/T 576—2015），包含病毒分離、電鏡檢查、包涵體檢查、中和試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)等技術(shù)。這些方法大多操作復(fù)雜，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，敏感性不高，結(jié)果判定受人為主觀性因素影響大[7-9]；而常規(guī)PCR 檢測(cè)方法對(duì)引物特異性要求較高，容易被污染。

血清抗體間接ELISA 方法，試驗(yàn)材料易獲取，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境、設(shè)備及人員要求較低，檢測(cè)速度快，且敏感性高于中和試驗(yàn)，結(jié)果判定更為簡(jiǎn)單，在臨床檢測(cè)和大面積疫苗免疫抗體監(jiān)測(cè)等方面具有重要價(jià)值，對(duì)疫情的緊急處理及防控意義重大，適合于大面積推廣應(yīng)用。本研究所建立的檢測(cè)CaPV-P32抗體的間接ELISA 方法可準(zhǔn)確檢測(cè)動(dòng)物血清中的保護(hù)性中和抗體水平，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，可較為客觀地評(píng)價(jià)羊痘疫苗免疫動(dòng)物的抗體免疫保護(hù)水平。建立敏感性高、特異性強(qiáng)、高通量、操作簡(jiǎn)便的CaPV-P32 中和抗體ELISA 檢測(cè)方法，對(duì)于大批量臨床樣本抗體檢測(cè)、基層樣本篩查以及加快羊痘凈化進(jìn)程等方面具有重要價(jià)值[8-12]。

建立穩(wěn)定的CaPV-P32 抗體ELISA 檢測(cè)方法的核心是表達(dá)與純化出具備天然結(jié)構(gòu)的CaPV P32蛋白。原核表達(dá)系統(tǒng)雖然操作簡(jiǎn)單，蛋白表達(dá)量高，但是表達(dá)出的抗原往往是包涵體結(jié)構(gòu)，不具有天然結(jié)構(gòu)，因而使抗原與動(dòng)物體內(nèi)抗體結(jié)合的匹配性出現(xiàn)差異。因此，大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的CaPV-P32 包涵體抗原無(wú)法較好地識(shí)別、親和動(dòng)物體內(nèi)的中和抗體，很容易造成檢測(cè)敏感性不高或者非特異性反應(yīng)原因?qū)е碌募訇?yáng)性樣本增高等現(xiàn)象。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為經(jīng)典的真核抗原表達(dá)系統(tǒng)具有原核表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，可以為表達(dá)的重組蛋白提供甲基化、糖基化、磷酸化、翻譯折疊等翻譯后修飾，從而使表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與生物活性更接近于病毒的天然結(jié)構(gòu)蛋白。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白是通過(guò)多角體啟動(dòng)子發(fā)生作用，在大量表達(dá)外源插入目的蛋白的同時(shí)，不影響病毒在Sf9 細(xì)胞中的增殖。本研究將編碼CaPV P32 抗原的核苷酸序列優(yōu)化為適合在Sf9 細(xì)胞中表達(dá)的偏好密碼子，去除輸水的跨膜區(qū)序列，質(zhì)粒轉(zhuǎn)座后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞形成桿狀病毒，利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)制備出了更接近病毒天然結(jié)構(gòu)的重組CaPV P32 蛋白，為開(kāi)發(fā)商品化的CaPV中和抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)CaPV 抗體使用的ELISA 試劑盒大多為國(guó)外進(jìn)口，成本高、進(jìn)口周期長(zhǎng)，給基層動(dòng)物疫病防控工作帶來(lái)了較大困難。本研究建立的CaPV-P32 抗體ELISA 檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的血清中和抗體檢測(cè)方法相比，符合率高達(dá)96.67%，在保證檢測(cè)方法特異性的同時(shí)，檢測(cè)敏感性比血清中和檢測(cè)方法更高。同時(shí)本研究建立的CaPV-P32 抗體ELISA 檢測(cè)方法適合于高通量檢測(cè)，可進(jìn)一步完善為成熟產(chǎn)品，用于基層羊痘疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、疫情監(jiān)控等，因而具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。