非洲馬瘟病毒實時熒光RT-RPA快速檢測方法的建立

史衛(wèi)軍，林彥星，黃超華，曹琛福，曾少靈，吳 江，劉建利，陳 兵，阮周曦，花群義

（深圳海關(guān)動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

非洲馬瘟（African horse sickness，AHS）是由非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）感染馬屬動物引起的一種急性或亞急性非接觸性蟲媒傳染病[1]，擬蚊庫蠓（Culicoides imicola）是其主要傳播媒介[2]，動物發(fā)病后以發(fā)熱、水腫、臟器出血為主要特征。所有馬屬動物均可感染AHSV，馬最易感，騾和驢次之，易感動物感染后病死率可達(dá)95%[3]。該病主要分布在非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)，地中海周邊國家、中東、歐洲等地偶有發(fā)生，近年來在亞洲個別國家也有流行，我國尚未有AHS 流行的報道[4]。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病和要重點防范的外來動物疫病。

AHSV 屬于呼腸病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus genus）成員，已知有9 種血清型，不同血清型病毒毒力不同，各型之間具有交互免疫關(guān)系，如1 型和2 型，3 型和7 型，5 型與8 型，6型與9 型[5-6]。AHSV 基因組由10 個大小不等的雙鏈RNA 片段構(gòu)成，編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1—VP7）和4 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1—NS3、NS3A）。其中，VP7 蛋白在AHSV 各血清型中高度保守，是病毒血清群的特異性抗原[7]，因此編碼VP7 蛋白的S7基因常被用于AHSV 檢測[8]。

目前國內(nèi)外學(xué)者已建立了多種AHSV 檢測方法，如常規(guī)RT-PCR、實時熒光RT-PCR、RT-LAMP 等，但這些方法均耗時較長，且操作復(fù)雜。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）是一種在恒溫（37～42 ℃）條件下即可實現(xiàn)核酸擴(kuò)增的新技術(shù)，反應(yīng)程序簡單，沒有PCR 的高溫變性、退火和延伸等步驟，而且反應(yīng)時間不到PCR 的20%。實時熒光RPA 方法是將熒光探針技術(shù)與RPA 技術(shù)相結(jié)合，在20 min 內(nèi)直接通過便攜式等溫擴(kuò)增儀讀取檢測結(jié)果的新方法，在動物疫病現(xiàn)場快速診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。本研究選取AHSVS7基因保守序列為靶基因，通過設(shè)計特異性引物和探針，建立了AHSV 實時熒光RT-RPA 檢測方法，以期為AHS 防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒和樣本

根據(jù)GenBank中發(fā)布的AHSVS7基因序列（登錄號：KT187143.2），合成該基因片段并克隆到pMD18-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為AHSVVP7。藍(lán)舌病病毒（BTV）滅活抗原、鹿流行性出血癥病毒（EHDV）滅活抗原，由作者所在實驗室保存；馬流感病毒（EIV）滅活抗原、馬傳染性貧血病病毒（EIAV）滅活抗原、馬動脈炎病毒（EAV）滅活抗原，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；40 份馬血和20 份驢血臨床樣品，采自云南、內(nèi)蒙古、廣西等地。

1.2 主要試劑和儀器

RNA 提取試劑盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit，購自美國Thermo 公司；實時熒光RT-RPA 擴(kuò)增試劑盒Twist Amp exo RT kit，購自英國TwistDx 公司；一步法熒光定量RT-PCR 試劑盒AgPath-IDTMOne Step RT-PCR Kit，購自美國ABI 公司。全自動磁珠提取純化系統(tǒng)，購自美國Thermo 公司；T16-ISO 等溫擴(kuò)增儀，購自澳大利亞Axxin 公司；7500 實時熒光PCR 儀，購自美國ABI 公司。

1.3 引物和探針設(shè)計

分析GenBank 中公布的AHSV 9 種血清型S7基因保守序列，根據(jù)RPA 引物和探針設(shè)計原則，設(shè)計多條特異性引物和探針，通過交叉試驗篩選最佳組合。

1.4 核酸提取

按照RNA 抽提試劑盒說明書，分別提取滅活抗原和臨床樣品核酸，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

按照Twist Amp exo RT Kit 試劑盒說明書進(jìn)行RPA 擴(kuò)增。分別吸取水化緩沖液29.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.1 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，DEPC 水11.2 μL，模板2.0 μL，混合均勻后轉(zhuǎn)移至含有凍干酶粉反應(yīng)管中，震蕩混勻后加入醋酸鎂溶液（280 mmol/L）2.5 μL，混勻后將反應(yīng)管置入等溫擴(kuò)增儀中，在恒溫條件下反應(yīng)4 min 后取出再次混勻，繼續(xù)反應(yīng)16 min，實時監(jiān)測FAM熒光信號。反應(yīng)溫度分別設(shè)置為37、38、39、40、41、42 ℃，篩選最佳溫度。

1.6 特異性試驗

在最佳反應(yīng)溫度下，分別對AHSV-VP7、BTV、EHDV、EIV、EIAV、EAV等進(jìn)行RT-RPA檢測，并設(shè)置陰性和空白對照。

1.7 靈敏度試驗

測定重組質(zhì)粒AHSV-VP7 濃度，根據(jù)公式：拷貝數(shù)（copies/μL）=6×1023×重組質(zhì)粒濃度×10-9/ 堿基數(shù)×660，得到AHSV-VP7 拷貝數(shù)為2.36×109copies/μL[10]。用DEPC 水 對AHSV-VP7 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，得到濃度范圍為2.36×104～2.36×100copies/μL 的系列稀釋樣品。同時使用RT-RPA 法和實時熒光RT-PCR 法[11]對上述系列稀釋樣品進(jìn)行檢測，測定本方法的靈敏度。

1.8 重復(fù)性試驗

選取濃度為2.36×104、2.36×101、2.36×100copies/μL 的重組質(zhì)粒AHSV-VP7 作為模板分別進(jìn)行RT-RPA 試驗，重復(fù)檢測3 次，分析該方法的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品檢測

利用本研究建立的RT-RPA 法和實時熒光RTPCR 法，同時對40 份馬血樣品和20 份驢血樣品進(jìn)行平行檢測，計算兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)條件確定

通過交叉試驗篩選最佳引物和探針組合，即選擇其中1 條上游引物和探針，對所有下游引物進(jìn)行篩選，然后根據(jù)篩選出來的最優(yōu)下游引物，篩選其他上游引物，通過比較熒光增量初始時間、熒光增量大小等確定最佳引物探針組合（表1）。采用以上引物探針組合，在相同反應(yīng)體系和等量模板條件下，確定最佳反應(yīng)溫度為40 ℃。

表1 實時熒光RT-RPA 引物和探針

2.2 特異性試驗

以AHSV-VP7、BTV、EHDV、EIV、EIAV、EAV 核酸為模板進(jìn)行RT-RPA 特異性試驗。試驗結(jié)果（圖1）顯示，僅AHSV-VP7 出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他病毒核酸及陰性和空白對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明本方法特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確檢測AHSV 核酸，而與其他病原無交叉反應(yīng)。

2.3 靈敏度試驗

選取濃度為2.36×104～2.36×100copies/μL 的AHSV-VP7 核酸作為模板分別進(jìn)行RT-RPA 試驗和實時熒光RT-PCR 試驗。試驗結(jié)果（圖2～3）顯示，2 種方法的最低檢出限均為2.36×101copies/μL，說明本研究建立的RT-RPA 法與WOAH 推薦的實時熒光RT-PCR 法靈敏度相當(dāng)，且RT-RPA 反應(yīng)條件簡單且無需大型儀器設(shè)備，檢測時間僅需20 min，適合現(xiàn)場快速檢測。

2.4 重復(fù)性試驗

將濃度為2.36×104、2.36×101、2.36×100copies/μL 的AHSV-VP7 分別用RT-RPA 法 重復(fù)檢測3 次。結(jié)果（圖4）顯示，2.36×104和2.36×101copies/μL 兩個濃度均觀察到相應(yīng)的熒光曲線，表明重復(fù)性良好；而2.36×100copies/μL 未出現(xiàn)熒光曲線，再次驗證了本方法的最低檢測限為2.36×101copies/μL。

2.5 臨床樣本檢測

對臨床收集的40 份馬血樣品和20 份驢血樣品分別進(jìn)行RT-RPA 和實時熒光RT-PCR 檢測。結(jié)果顯示，60 份臨床樣本的檢測結(jié)果均為陰性，符合率為100%。

3 討論

AHS 是所有馬疫病中致死率最高的疫病，曾在歐洲和非洲發(fā)生過大流行，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)馬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，是全球養(yǎng)馬業(yè)發(fā)展最大的潛在威脅[12]。我國雖為AHS 無疫國，但近兩年周邊臨近國家陸續(xù)發(fā)生AHS 疫情，增大了AHSV 傳入我國的風(fēng)險。2020 年3 月27 日，泰國農(nóng)業(yè)與合作部向WOAH 通報AHS 疫情[13]，此次疫情造成泰國4 個省至少131 例馬死亡。2020 年9 月2 日，馬來西亞農(nóng)業(yè)與農(nóng)基產(chǎn)業(yè)部向OIE 緊急報告[14]，該國登嘉樓州（Terengganu）發(fā)生AHS 疫情。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好非洲馬瘟防范工作的通知[15]，泰國疫情是我國周邊國家首次報告的AHS 疫情，最近疫點與我國邊境直線距離不足800 km，且我國已監(jiān)測到AHSV 傳播媒介的存在，AHSV 引入風(fēng)險較高。另外，隨著我國對外交流的不斷加深和賽馬業(yè)的蓬勃發(fā)展，AHSV 通過跨境比賽馬匹、進(jìn)口種馬和馬產(chǎn)品等傳入我國的風(fēng)險也在增大。該病目前尚無有效治療手段，一旦傳入我國，不僅會危及到養(yǎng)馬業(yè)的健康發(fā)展，也會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會影響。因此，建立一種快捷有效的AHSV 檢測方法是防控AHS 的必要措施之一。

與PCR 方法不同，RPA 是一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)反應(yīng)條件要求低，反應(yīng)時間短，耗能少且氣溶膠污染風(fēng)險低，是目前動物疫病診斷中應(yīng)用較為廣泛的一種新技術(shù)。本研究以AHSVS7基因保守序列為靶基因，設(shè)計并篩選出一組特異性引物和探針。試驗結(jié)果表明：本研究建立的實時熒光RT-RPA 方法特異性好，與其他常見馬病病原無交叉反應(yīng)；靈敏度高，與WOAH 推薦的實時熒光RT-PCR 法靈敏度相當(dāng)，最低檢出限為2.36×101copies/μL；20 min 即可實現(xiàn)AHSV 的快速檢測且重復(fù)性好。本方法的建立為AHS 防控提供了技術(shù)支撐。