新疆石河子市牛源大腸桿菌分離鑒定及對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性分析

許淑蕓，何白雪，俞 杰，馬 雪，胡曉彥，鄒思穎，李 劼，周 霞，黃 新，鐘發(fā)剛，吳桐中，韓猛立，張星星

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000）

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是一種重要的人獸共患食源性病原菌[1]。新疆是我國重要的養(yǎng)牛地區(qū)，牛飼養(yǎng)量逐年增加，牛大腸桿菌病時有發(fā)生[2]。大腸桿菌在規(guī)?；B(yǎng)殖場可引起犢牛腹瀉、出血性腸炎、肺炎、腦炎以及敗血癥等病癥，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時大腸桿菌也是組成人和動物消化道正常菌群的重要細(xì)菌，在維持機(jī)體生態(tài)平衡和健康狀態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。研究[3-4]顯示，來自健康動物的大腸桿菌也表現(xiàn)出越來越明顯的耐藥特性。而腸道是大腸桿菌的最大貯存庫，其耐藥性可以通過食物鏈和直接接觸傳遞，因此給公共衛(wèi)生帶來了一定的潛在威脅。McGowan 等[5]證實(shí)，存在于少數(shù)細(xì)菌中的碳青霉烯酶已經(jīng)在一些重要的腸道菌群中被發(fā)現(xiàn)。

目前獸醫(yī)臨床控制或治療細(xì)菌性病原引起的感染主要使用抗生素。而抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致致病性大腸桿菌多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使大腸桿菌病防治效果明顯降低。研究[6]表明，β-內(nèi)酰胺類抗生素是牛場常用的一類藥物，而耐藥細(xì)菌主要通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺水解酶來抑制β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥活性。顧曉曉等[7]研究報道，新疆部分地區(qū)牛、羊致病性大腸桿菌對頭孢唑林、阿莫西林等藥物具有一定耐藥性。目前，研究石河子市牛源正常菌群大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥表型和相關(guān)耐藥基因攜帶情況的報道較少。因此，本研究在分離鑒定健康牛腸道正常大腸桿菌基礎(chǔ)上，分析分離株對部分β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥表型和相關(guān)耐藥基因攜帶情況，以期為牛源致病性大腸桿菌耐藥機(jī)制的深入研究以及石河子市減抗政策的加速實(shí)施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便來源 無菌采集新疆石河子市規(guī)模化牛場健康牛糞便樣本。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 2×TaqDNA 聚合酶、2×PCR Buffer、2×dNTP、LB 培養(yǎng)基、DL 2 000 DNA Marker 等，均為TaKaRa 公司產(chǎn)品；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1，8-13]，設(shè)計大腸桿菌通用引物16S rRNA，分子分型arpA、chuA、yjaA及TspE4.C2基因引物，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX-M、OXA、TEM及SHV引物。引物均由華大基因有限公司制備合成。相關(guān)信息見表1。

表1 大腸桿菌相關(guān)基因引物信息

1.1.4 藥敏紙片種類及規(guī)格 β-內(nèi)酰胺類藥物藥敏紙片種類及規(guī)格：頭孢唑林（Cefazolin）30 μg、阿莫西林（Amoxicillin）20 μg、頭孢拉定（Cefradine）30 μg、青霉素（Penicillin）10 U、頭孢噻肟（Cefotaxime）30 μg、頭孢西?。–efoxitin）30 μg、頭孢噻吩（Cephalothin）30 μg、氨芐西林（Ampicillin）10 μg、頭孢氨芐（Cephalexin）30 μg、頭孢吡肟（Cefepime）30 μg。藥敏紙片均由杭州微生物試劑有限公司合成制備。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 將無菌采集的樣本稀釋涂布于LB 培養(yǎng)基上，放置于恒溫箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；將符合要求的疑似菌接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行純化，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h；選取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的特征性菌落進(jìn)行涂片，革蘭染色鏡檢。選取疑似菌進(jìn)行生化鑒定，包括葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、IMViC（靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙二酰試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)）。

1.2.2 細(xì)菌16S rRNA 序列分析 以提取的分離菌基因組DNA 為模板，采用PCR 方法擴(kuò)增16S rRNA 序列，PCR 反應(yīng)均在20 μL 體系中進(jìn)行。PCR 總體系反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取6 μL 擴(kuò)增后產(chǎn)物，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析結(jié)果。

1.2.3 分離株系統(tǒng)進(jìn)化分群 參考Clermont[13]判定標(biāo)準(zhǔn)，采用多重PCR 方法進(jìn)行系統(tǒng)分群。PCR反應(yīng)均在50 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行。PCR 體系反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸110 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析結(jié)果。

1.2.4 細(xì)菌耐藥基因PCR 檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-12]合成耐藥基因，包括CTX-M、OXA、TEM、SHV。引物信息見表1。在提取分離菌DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為40 μL?？傮w系反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸50 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析結(jié)果。

1.2.5 耐藥表型檢測 參照CLSI 于2012 年制定的藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)（K-B 法）[14]，將分離菌菌液濃度調(diào)節(jié)至0.5 麥?zhǔn)媳葷岫?，?00 μL 均勻涂布在LB 平板上，靜置5 min，待菌液不流動后，使用鑷子將藥敏紙片貼于平板上，紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平板邊緣不少于15 mm。將平板倒置于恒溫箱內(nèi)37 ℃，培養(yǎng)16 h，檢測分離菌對10 種抗生素的耐藥表型。根據(jù)抑菌圈大小判斷分離細(xì)菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

分離株在LB 培養(yǎng)基上生長出白色、圓潤、表面略凸、邊緣光滑的小菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上生長出紅色、圓潤、表面微凸、邊緣光滑的菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長出黑色、光滑、表面微凸、邊緣光滑帶金屬光澤的小菌落（圖1）。鏡檢結(jié)果顯示：分離菌株為革蘭染色紅色陰性、兩端鈍圓的短小桿菌，與大腸桿菌特點(diǎn)一致。

經(jīng)16S rRNA 基因序列PCR 擴(kuò)增、電泳，最終擴(kuò)增出大小約100 bp 目的基因條帶（圖2）。測序結(jié)果（圖3）顯示，分離株與GenBank 中相應(yīng)基因序列同源性在99%以上。結(jié)合生化反應(yīng)與16S rRNA 基因序列分析結(jié)果，確定分離菌株為大腸桿菌。

2.2 分離株系統(tǒng)進(jìn)化分群

采用Clermont 的四重PCR 擴(kuò)增方法，進(jìn)行arpA、chuA、yjaA和TspE4.C2目的基因擴(kuò)增、電泳。結(jié)果顯示：100 株大腸桿菌中，38 株屬于A 群大腸桿菌，53 株屬于B1群大腸桿菌，7 株屬于C 群大腸桿菌，2 株屬于F 群大腸桿菌。部分分型結(jié)果見圖4。

2.3 細(xì)菌耐藥基因PCR 檢測

對100 株大腸桿菌進(jìn)行blaCTX-M、blaOXA、blaTEM和blaSHV耐藥基因PCR 擴(kuò)增，結(jié)果在5 株分離菌中檢測到blaSHV基因，1 株中檢測到blaCTX-M基因，未檢測到blaOXA和blaTEM基因片段。部分結(jié)果見圖5。

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

分離菌株對頭孢唑林的耐藥性最高，對頭孢吡肟的敏感性最高（表2）?？? 種藥物的有16株，占16%；抗2 種藥物的有32 株，占32%；抗3 種藥物的有21 株，占21%；抗4 種藥物的有10株，占10%；抗5 種藥物的有10 株，占10%；抗6 種藥物的有1 株，占1%。耐藥菌株占總菌株數(shù)的90%。各分群的耐藥表型測定結(jié)果（表3）顯示：A 群大腸桿菌對頭孢唑林、阿莫西林、頭孢拉定耐藥率分別為57.89%、50.00%、47.37%，B1群大腸桿菌對頭孢唑林、頭孢拉定、阿莫西林、青霉素耐藥率分別為77.36%、52.83%、50.94%、33.96%，C 群大腸桿菌對阿莫西林、頭孢唑林耐藥率分別為71.43%、57.14%，F(xiàn) 群大腸桿菌對頭孢唑林、青霉素、頭孢拉定耐藥率均為100%。

表2 100 株牛源大腸桿菌對10 種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型測定結(jié)果

表3 分離菌各分群對10 種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型測定結(jié)果

3 討論

16S rRNA 基因存在于所有生物的染色體基因組中，具有高度保守性，因此在細(xì)菌分離鑒定時，除了用常規(guī)生化反應(yīng)鑒定外，結(jié)合16S rRNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，能更準(zhǔn)確完成細(xì)菌鑒定[15]。根據(jù)毒力基因建立的系統(tǒng)發(fā)育群系，將大腸桿菌分為7 個系統(tǒng)發(fā)育類群，即A、B1、B2、C、D、E 和F，其中強(qiáng)毒性腸外菌株主要屬于B2群，也有部分屬于D群，而大多數(shù)共生菌株屬于A 群[16]。本研究中的100 株分離菌與Clermont 分型結(jié)果基本一致。

致病性大腸桿菌感染的控制與治療主要依靠抗生素，因而導(dǎo)致不同來源致病性大腸桿菌對不同抗生素表現(xiàn)廣泛的耐藥性。而動物腸道中存在的正常菌群大腸桿菌，也對不同抗菌藥物逐漸表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，這給動物本身和人類生物安全帶來了潛在威脅[17]。本研究中，來自牛腸道正常菌群大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類部分抗菌藥的耐藥率雖然低于顧曉曉等[7]報道的新疆部分地區(qū)牛、羊致病性大腸桿菌對相應(yīng)抗生素的耐藥率，但對頭孢唑林、阿莫西林的耐藥率分別達(dá)到69%和52%，與張濟(jì)培等[10]、韋慶蘭等[18]對水禽源大腸桿菌的耐藥性檢測結(jié)果類似。本研究中，A 群分離菌對頭孢唑林、阿莫西林、頭孢拉定的耐藥率較高，B1群分離菌對頭孢唑林、頭孢拉定、阿莫西林、青霉素的耐藥率較高，C 群分離菌對阿莫西林、頭孢唑林的耐藥率相對較高，F(xiàn) 群分離菌對頭孢唑林、青霉素、頭孢拉定的耐藥菌株占比均為100%，表明正常腸道大腸桿菌對青霉素類抗生素以及部分一代頭孢菌素類藥物具有較高的耐藥性，而耐藥性和菌株Clermont 分型無明顯關(guān)系。

研究[19]表明，blaSHV主要與青霉素類抗生素如阿莫西林耐藥基因相關(guān)，blaCTX-M與頭孢噻吩等抗生素耐藥基因相關(guān)，blaOXA與三代頭孢菌素類抗生素如頭孢西丁耐藥基因相關(guān)，blaTEM與氨芐西林、青霉素及頭孢噻吩類抗生素耐藥基因相關(guān)。冀亞路等[20]對吉林省規(guī)?；i場斷奶仔豬進(jìn)行大腸桿菌耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)，blaTEM和blaCTX檢測率分別為30.8%和15.4%，而blaSHV檢測率為0；表型檢測發(fā)現(xiàn)，對青霉素耐藥率為99.8%，阿莫西林為81.6%，氨芐西林為100%。王蕾等[21]在烏蒙地區(qū)進(jìn)行威寧黃牛糞源大腸桿菌研究發(fā)現(xiàn)，blaTEM和blaSHV檢出率分別為24%和19%，對青霉素耐藥率只有13%。本研究的100 株分離菌株中，有1 株檢測到blaCTX-M基因，5 株檢測到blaSHV基因，均未檢測到blaOXA和blaTEM基因。本研究結(jié)果與其他動物糞源大腸桿菌攜帶耐藥基因情況存在明顯差異，推測不同地區(qū)、不同來源大腸桿菌可能與地區(qū)用藥、菌群差異以及耐藥基因的傳遞方式有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，耐藥表型與耐藥基因檢出率也有不一致現(xiàn)象，如blaSHV基因檢出率最高，而阿莫西林在耐藥表型檢測中的耐藥率超過了50%，青霉素僅為26%，其中是否存在其他未檢/未發(fā)現(xiàn)的耐藥基因或其他機(jī)制介導(dǎo)的耐藥，還需要進(jìn)一步研究。牛正常腸道菌群細(xì)菌耐藥性普遍增強(qiáng)的現(xiàn)象提示，應(yīng)加快減抗政策的實(shí)施。