基于網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接探討黃莪膠囊治療良性前列腺增生癥的作用機制研究*

郭 俊晏 斌杜冠潮趙 豐鄧楹君王 浩高慶和郭 軍**

1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院（北京 100091）；2.北京中醫(yī)藥大學（北京 100029）

良性前列腺增生癥 （benign pr ostatic hyperplasia，BPH）是導致中老年男性出現(xiàn)排尿障礙的最常見的疾病，該病的主要臨床表現(xiàn)包括前列腺體積的增大與下尿路癥狀[1]。該病屬中醫(yī)“精癃”、“癃閉”范疇[2]。BPH的患病率隨著男性年齡的增長而明顯升高?，F(xiàn)代醫(yī)學的藥物治療以α受體阻滯劑和5α還原酶抑制劑為主。中醫(yī)藥治療具有多靶點調(diào)控與個性化診療的特點，在BPH的治療上具有一定優(yōu)勢。其中，黃莪膠囊作為治療BPH的常用上市中成藥，具有益氣活血、清熱利濕的功效，可降低BPH患者IPSS評分，提升生活質(zhì)量，減小前列腺體積，改善最大尿流率[3]。

復方中藥對于疾病的治療是基于其多成分的特點，從多個靶點與通路進行調(diào)節(jié)。網(wǎng)絡(luò)藥理學是將醫(yī)學、大數(shù)據(jù)科學、生物信息學等多學科進行交叉融合，以反映藥物對于疾病的干預機制的方法。本次研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接方法，以探究黃莪膠囊對于BPH的作用機制，為后續(xù)的研究提供參考。

方 法

一、黃莪膠囊相關(guān)靶點的篩選

應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）分別檢索黃莪膠囊中12味中藥的有效成分。在TCMSP中，ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）屬性值分別選用藥物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為黃莪膠囊有效成分的統(tǒng)一篩選標準。根據(jù)已發(fā)表的文獻對于12味中藥的有效成分進行補充，并將補充獲取的有效成分在TCMSP中再次檢索，確保有效成分符合統(tǒng)一篩選標準。通過TCMSP檢索并收集黃莪膠囊中12味中藥有效成分所對應的蛋白質(zhì)靶點信息。下載Uniport數(shù)據(jù)庫[4]中已驗證的人類蛋白質(zhì)與基因信息，并將所收集的蛋白質(zhì)靶點信息進行標準化處理為統(tǒng)一的基因名。

二、BPH靶點的獲取

以“benign prostatic hyperplasia”、“benign prostatic hypertrophy”、“BPH”等為關(guān)鍵詞，在GeneCards[5]、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中搜索并獲得與BPH相關(guān)的靶點。GeneCards數(shù)據(jù)庫中以Relevance score量化靶點與疾病的關(guān)系，若該數(shù)據(jù)庫中靶點信息過多，則以大于Relevance score的中位數(shù)值為篩選標準，篩選出相關(guān)性更高的靶點。將三大數(shù)據(jù)庫中的靶點信息進行合并且去除重復值，得到與BPH相關(guān)的靶點信息。

三、黃莪膠囊PPI（protein-protein interaction）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

旨在了解黃莪膠囊藥物成分的相關(guān)靶點與BPH靶點的相互作用關(guān)系，故利用R軟件，將上述得到的黃莪膠囊靶點與BPH相關(guān)靶點相映射，取二者交集，得到黃莪膠囊治療BPH的潛在作用靶點并繪制韋恩圖。將潛在作用靶點導入STRING平臺[6]，將蛋白種類設(shè)置為“Homosapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”＞0.9，其余條件均為默認設(shè)置，構(gòu)建黃莪膠囊治療BPH的PPI網(wǎng)絡(luò)。

將基于STRING平臺得出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導出，利用Cytoscape 3.8.2軟件[7]進行PPI網(wǎng)絡(luò)的圖形繪制，利用Cytoscape中Analyze Network的功能對于PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲得出等級值（degree）、緊密中心度（Closeness Centrality）、鄰域連通性（Neighborhood Connectivity）與介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）等，按照degree進行排序，并按照degree值的大小設(shè)置節(jié)點大小、顏色；按照蛋白與蛋白互作聯(lián)系的緊密性設(shè)置連線的顏色、粗細，最終將黃莪膠囊治療BPH的核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化呈現(xiàn)。

四、富集分析

Metascape平臺是功能強大的基因功能注釋分析工具，該平臺數(shù)據(jù)更新速度快，覆蓋多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，可對基因或蛋白質(zhì)進行批量注釋與分析[8]。

將黃莪膠囊治療BPH的核心靶點數(shù)據(jù)導入至Metascape平臺，對其進行基因本體（Geneontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，其中GO分析包括BP（biological process）、CC（cellular component）、MF（molecular function）。將數(shù)據(jù)庫與基因集的物種限定為“Homosapiens”，閾值設(shè)置P＜0.01。并將數(shù)據(jù)結(jié)果導入至R軟件中，分別以柱狀圖與氣泡圖的形式呈現(xiàn)。

五、藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建黃莪膠囊成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用內(nèi)置工具Network Analysis功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析，依據(jù)連接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及緊密度（Closenesss Centrality）等判斷核心成分、靶點與通路之間的關(guān)系。

六、分子對接驗證

選擇黃莪膠囊成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中degree排名前5的靶點，在PDB數(shù)據(jù)庫篩選其PDB ID，并下載靶點的3D結(jié)構(gòu)，運用PyMOL軟件對結(jié)構(gòu)進行去除水分子、去除磷酸根等操作。再應用AutoDockTools 1.5.6及AutoDock Vina軟件[9]對degree排名前3的化合物分子進行對接，并計算對接能量。

結(jié) 果

一、黃莪膠囊治療BPH潛在靶點的獲取

通過篩選，黃莪膠囊的12味中藥共獲得85個活性成分；獲取黃莪膠囊作用靶點286個，BPH靶點986個。利用R軟件，將上述黃莪膠囊靶點與BPH靶點進行映射，如圖1所示，得到133個黃莪膠囊治療BPH的潛在靶點。

圖1：黃莪膠囊成分-BPH靶點韋恩圖

二、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

如圖2所示，黃莪膠囊用于BPH治療中相關(guān)度較高的靶點為腫瘤抑制因子p53、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）、腎上腺素能受體α1a（adrenoceptor alpha 1A，ADRα1a）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，pkb1/AKT1）、內(nèi)皮素1（Endothelin-1，ET-1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)、雄激素受體（androgen receptor，AR）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase 3，NOS3)、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、表 皮 生 長 因 子 受 體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等。其中，相關(guān)度排名前10的靶點見表1。

表1 黃莪膠囊核心靶點靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

圖2 黃莪膠囊干預BPH的潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

三、GO功能、KEGG通路富集分析及藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

GO分析得到分子功能145個，生物過程2173個，細胞組分74個。前20條GO分析結(jié)果如圖3所示，主要涉及凋亡信號通路轉(zhuǎn)導 （regulation of apoptotic signaling pathway）、氧化 應激 （response to oxidative stress）等過程。

圖3 黃莪膠囊干預BPH潛在靶點的GO分析結(jié)果

KEGG分析共得到322條具有顯著意義的通路，前20條與BPH相關(guān)度較高的通路如圖4所示，主要包括抗腫瘤、促進凋亡、抑制炎癥等。

圖4 黃莪膠囊干預BPH潛在靶點的KEGG分析結(jié)果

藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)如圖5所示。依據(jù)degree值篩選出排名前3的化合物分子，見表2。

圖5 黃莪膠囊藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表2 黃莪膠囊主要有效成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

四、分子對接預測黃莪膠囊活性成分與潛在靶點的結(jié)合能力

對黃莪膠囊藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析中得出的核心有效成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶點p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ED-1進行分子對接。若結(jié)合能＜0 kcal·mol-1，則配體小分子可和受體蛋白自發(fā)結(jié)合，若結(jié)合能＜-5.0 kcal·mol-1，表明其結(jié)合性好，小于-7.0 kcal·mol-1結(jié)合活性較強，結(jié)合能越小對接越好[10]。對接結(jié)果見表3。93.3%的有效成分與靶點蛋白結(jié)合較好，20%的有效成分與靶點蛋白結(jié)合較強，其中β-谷甾醇與MAPK1的結(jié)合最好。利用PyMOL對成分與靶點對接后的分子表面結(jié)構(gòu)與棍狀結(jié)構(gòu)進行可視化呈現(xiàn)，以結(jié)合程度最高的β-谷甾醇與MAPK為例進行展示，結(jié)果見圖6、圖7。

表3 黃莪膠囊中有效成分與核心靶點結(jié)合能預測

圖6 β-谷甾醇與MAPK1結(jié)合的分子表面結(jié)構(gòu)

討 論

中醫(yī)雖無BPH的病名，但在古籍中早有記載，當屬于“癃閉”、“精癃”的范疇?！端貑枴ば魑鍤馄吩唬喊螂撞焕麨轳患s為遺溺?！额愖C治裁·閉癃遺溺》曰：閉者小便不通，癃者小便不利。氣虛、瘀血、濕熱為該病的主要致病因素[11]。病變位于腎與膀胱，證屬本虛標實，益氣活血，清熱利濕法是BPH的重要治法。

黃莪膠囊以黃芪、桃仁為君藥，黃芪甘溫，為補氣之要藥，既可益氣固表、利尿消腫，亦能助氣行血以化瘀；桃仁入膀胱經(jīng)，功善祛瘀?！皻鉃檠畮洠獮闅庵浮?，黃芪與桃仁相伍，益氣活血，互增效用。臣藥莪術(shù)、大黃、益母草均有活血散結(jié)之用；土茯苓祛濕熱，亦有入絡(luò)之功；夏枯草乃散結(jié)常用之品，兼有和陽養(yǎng)陰之能。佐藥北豆根可助土茯苓清熱利濕；肉桂溫熱之性既可助膀胱氣化以祛瘀，亦能防全方苦寒太過。使藥牛膝利尿通淋，且能引血下行，使藥可直達病所。全方共奏益氣、活血、散結(jié)、利濕之用。

一、潛在有效成分分析

本次研究發(fā)現(xiàn)共獲得85個活性成分，作用靶點286個，將最終數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.8.2中，利用Analyze Network計算活性成分的節(jié)點值，發(fā)現(xiàn)黃莪膠囊中degree最高的有效成分包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）與蘆薈大黃素（aloe-emodin）等。

槲皮素與山奈酚均為天然黃酮類化合物。其中，槲皮素多從植物中提取，具有多重生物活性，有降低氧化應激、抗炎等作用[12]。A.Ghorbanibirgani通過隨機雙盲試驗，應用槲皮素對BPH患者進行干預發(fā)現(xiàn)，槲皮素與安慰劑相比，可明顯降低前列腺癥狀評分，提升尿流率[13]。山奈酚又稱為山萘黃素、山奈素等，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理活性。山奈酚可抑制雙氫睪酮誘導的雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性、PSA和AR基因的表達以及LNCaP、BPH-1細胞的增殖，明顯降低BPH大鼠前列腺指數(shù)，改善BPH大鼠的病理性質(zhì)[14]。β-谷甾醇作為植物甾醇的一種，存在于眾多植物的細胞膜中，有降血脂、抗炎、抗腫瘤的作用[15]。Cosentino V等讓BPH患者連續(xù)3月，每隔3天服用一次含有β-谷甾醇的膳食補充劑，發(fā)現(xiàn)患者IPSS評分降低與尿流量的顯著增加[16]。蘆薈大黃素作為蒽醌類化合物有抗前列腺增生作用，可顯著降低BPH模型小鼠的前列腺系數(shù)[17]。

通過分子對接發(fā)現(xiàn)黃莪膠囊中的核心有效成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、蘆薈大黃素與關(guān)鍵靶點（p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ED-1）的結(jié)合活性較好，這也反應了預測的可靠性。

二、靶點分析

由于BPH的主要增生部位前列腺基質(zhì)的組成以平滑肌為主，富含大量α1腎上腺素受體（αadrenoceptor，α1-AR）。當交感神經(jīng)興奮后，去甲腎上腺素作用于α1-AR致平滑肌收縮，而出現(xiàn)動力性梗阻。黃莪膠囊對α1-AR存在競爭性拮抗作用[18]，以降低尿道平滑肌張力，緩解后尿道壓力以改善排尿癥狀。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在PI3K的激活下參與調(diào)控各種細胞功能，包括正常和惡性細胞的增殖、生存、代謝和血管生成[19]。研究發(fā)現(xiàn)AKT基因的過表達和前列腺體積的增大有關(guān)[20]。ET-1可介導前列腺平滑肌收縮，導致動力性梗阻癥狀的出現(xiàn)；董佳晨通過對空白組、模型組、黃莪膠囊高、低劑量組大鼠前列腺組織中內(nèi)皮素進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)ET-1在黃莪膠囊高、低劑量組中表達較模型組明顯降低，發(fā)現(xiàn)黃莪膠囊可降低ET-1在BPH組織中的表達水平[21]，改善尿道出口梗阻的癥狀。

三、生物富集分析

通過GO功能富集分析可知，生物學進程包括凋亡信號通路、氧化應激反應、蛋白磷酸化正調(diào)控、對生長因子的反應等，主要涉及蛋白激酶活性、激酶綁定、轉(zhuǎn)錄因子綁定、信號受體調(diào)節(jié)活性等方面的功能。

依據(jù)KEGG富集分析結(jié)果，并結(jié)合黃莪膠囊的前期實驗研究及目前BPH研究進展，筆者認為PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、FoxO信號通路可能是黃莪膠囊治療BPH的主要作用通路。

PI3K（Phosphoinositide-3 kinase）屬于磷脂激酶家族，是肌醇及磷脂酰肌醇的主要激酶。AKT（Protein kinase B）是PI3K下游信號通路中最為重要的一個蛋白，它是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。該信號通路調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡[22]。Karli Sreenivasulua通過q-PCR評估27名年齡在55歲至75歲之間的BPH患者前列腺組織中PI3K和AKT的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)其表達隨著前列腺體積的增加而顯著增加[20]。故預測PI3K/AKT通路的過表達會導致BPH中細胞凋亡減少從而導致前列腺體積的增大。

FoxO信號通路中，F(xiàn)oxO亞家族可促進細胞凋亡、抑制細胞周期進程和自噬[23]。Dey Strom和Gustafsson指出雌激素受體-β可以通過增加FoxO3a的轉(zhuǎn)錄，通過caspase-9途徑促進前列腺癌細胞的凋亡[24]。李琦等觀察到使用苦參堿抑制前列腺癌細胞增殖后FoxO1a、FoxO3a、FoxO4和FoxO6的表達顯著增加[25]，表明苦參堿可能通過FoxO信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡。雖然FoxO信號通路在前列腺增生方面的相關(guān)研究較少，但是以上結(jié)果表明FoxO信號通路可能在前列腺細胞增殖、凋亡和細胞周期中起到重要作用。

白細胞介素（IL-17）是新型炎癥細胞因子家族的創(chuàng)始成員。雖然IL-17的促炎特性是其宿主保護能力的關(guān)鍵，但不受限制的IL-17信號傳導自身免疫性疾病和癌癥進展有關(guān)[26]。在IL-17信號通路中，促炎性因子IL-17的表達升高會刺激IL-6和IL-8的多倍增長，IL-6和IL-8會促進BPH基質(zhì)生長[27]。

綜上所述，黃莪膠囊中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、蘆薈大黃素等有效成分可能通過作用于p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ET-1靶 點，調(diào) 控PI3K-Akt、FoxO、IL-17等信號通路，抑制前列腺細胞增殖、緩解后尿道壓力而治療BPH。