血睪屏障與男性避孕

孟志翔 呂金星

1.蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院；2.蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

一、介紹

血睪屏障（BTB）本質(zhì)是生精小管與睪丸血液之間的一層屏障，由間質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)皮基膜、結(jié)締組織、生精上皮基膜、生精細(xì)胞及支持細(xì)胞通過緊密連接、胞質(zhì)特化、橋粒和縫隙連接等連接復(fù)合體相互作用所形成[1-4]。其特有的微觀結(jié)構(gòu)，為精子發(fā)生提供了適宜的微環(huán)境，并參與調(diào)節(jié)生物分子的運(yùn)輸以及作為精子發(fā)生的免疫屏障[5]。血睪屏障對男性生育具有重要意義。然而，血睪屏障作為哺乳動物的組織屏障之一，也同樣阻礙了男性避孕藥進(jìn)入睪丸發(fā)揮作用。

研究表明，超過50%的男性有興趣使用可逆性避孕的方法[6]，許多女性也愿意她們的伴侶使用避孕藥[7]。在過去的20年中，激素性避孕藥的研發(fā)取得了重大進(jìn)展[8-9]，例如，注射雄激素（十一酸睪酮）、口服雄激素（十一酸二甲雄酮）、睪酮凝膠或雄激素植入物[10-14]，通過升高血清睪酮水平來干擾下丘腦-垂體-睪丸軸，抑制腦垂體分泌黃體生成素，導(dǎo)致間質(zhì)中的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雄激素減少，從而影響精子發(fā)生，由于下丘腦-垂體-睪丸軸被破壞，男性的其他激素依賴的生物功能（如血壓）和器官（前列腺）以及肌肉質(zhì)量都可能受到影響，導(dǎo)致產(chǎn)生副作用和男性的擔(dān)憂[15-18]，因此開發(fā)非激素類男性避孕藥是非常有必要的，在不干擾下丘腦-垂體-睪丸軸和血清睪酮水平的情況下，更好地在睪丸中發(fā)揮作用。近期關(guān)于血睪屏障中藥物動力學(xué)以及其他新興技術(shù)的研究，為男性避孕藥提供新的作用靶點(diǎn)和新前景。

二、血睪屏障的結(jié)構(gòu)和功能

（一）血睪屏障的結(jié)構(gòu)

血睪屏障主要是由支持細(xì)胞之間的緊密連接、胞質(zhì)特化、橋粒和縫隙連接組成的[3-4]，睪丸內(nèi)的緊密連接與胞質(zhì)特化共存并共同發(fā)揮作用。橋粒和縫隙連接存在于包含緊密連接和基底胞質(zhì)特化的質(zhì)膜區(qū)域之間。

緊密鏈接由相鄰的支持細(xì)胞構(gòu)成，支持細(xì)胞呈錐體形，形狀不規(guī)則，細(xì)胞基部緊貼基底膜，頂部可以到達(dá)生精小管的管腔，細(xì)胞側(cè)面和腔面凹凸交錯，相鄰細(xì)胞間鑲嵌著各級生精細(xì)胞，細(xì)胞側(cè)面近基部的相鄰細(xì)胞膜形成緊密連接。緊密連接的膜整合蛋白有許多種類，其中能夠調(diào)節(jié)緊密連接動力學(xué)以及能夠影響精子發(fā)生的蛋白主要有4類：Occludin蛋白、Claudin蛋白、JAMs家族（Junctional adheson molecules）、ZO（Zona Occludens）蛋白[19]。

胞質(zhì)特化，即睪丸特異的黏附連接，由位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池之間的六角形排列的絲狀肌動蛋白微絲組成。支持細(xì)胞之間的外質(zhì)特化被定義為基底的外質(zhì)特化，而支持細(xì)胞和成形的精子細(xì)胞之間的外質(zhì)特化被定義為頂端的外質(zhì)特化[20-21]。胞質(zhì)特化介導(dǎo)的粘附在很大程度上是由鈣粘連蛋白-連環(huán)蛋白多功能復(fù)合體構(gòu)成的，該復(fù)合體還調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架并促進(jìn)細(xì)胞極性[22-23]。

橋粒是介導(dǎo)強(qiáng)力黏附的細(xì)胞-細(xì)胞連接，而縫隙連接是細(xì)胞-細(xì)胞通道，允許代謝物、第二信使、離子和其他小于1KDa的分子擴(kuò)散[24-25]。緊密連接、胞質(zhì)特化和縫隙連接附著于肌動蛋白微絲[20,26]，而橋粒附著于中間絲[20]。

（二）血睪屏障的功能

1.為生精上皮周期提供不同的微環(huán)境：血睪屏障中的緊密連接將生精上皮分隔成基底室和近腔室，基底室靠近基膜，其內(nèi)有A型精原干細(xì)胞（包括Asingle（As）、Apaired（Apr）和Aaligned（Aal）型精原干細(xì)胞。）、B型精原細(xì)胞以及初級精母細(xì)胞（即前細(xì)線期精母細(xì)胞）。近腔室內(nèi)，精母細(xì)胞接連發(fā)生兩次減數(shù)分裂以發(fā)育成精子細(xì)胞，最終經(jīng)過分化形成正常的蝌蚪狀精子進(jìn)入曲細(xì)精管管腔。

2.調(diào)控各類生物分子的轉(zhuǎn)運(yùn)：在睪丸中，精子發(fā)生所需的營養(yǎng)物質(zhì)（例如糖類和氨基酸）、重要分子（例如激素和電解質(zhì)）以及危害精子發(fā)生的有害毒物（例如環(huán)境、毒物、藥物和化學(xué)品）都位于生精小管之間的間質(zhì)。血睪屏障的動態(tài)開合可調(diào)控這些物質(zhì)進(jìn)入減數(shù)分裂期和分裂后期的生殖在近腔室內(nèi)發(fā)生形態(tài)變化。因此，可為精子發(fā)生創(chuàng)建了一個適宜的微環(huán)境[1]。

3.構(gòu)建免疫屏障：確保免疫系統(tǒng)不能識別存在于生殖細(xì)胞表面的特異性抗原。最近的研究表明，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過產(chǎn)生干擾素（interferon，IFN）、白介素（interleukins，ILs）和細(xì)胞因子來維持獨(dú)特的防御系統(tǒng)。血睪屏障也阻止免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞進(jìn)入近腔室[27-29]。

4.賦予生精上皮極性：血睪屏障通過CRB（Crumbs）-PALS（protein associated with Lin Seven）-PATJ（Pals associated tight junction protein）、PAR3（partitioning defective 3）-PAR6-aPKC、DLG（Scribble Discs large）LGL（Lethal giant larvae）三種細(xì)胞極性復(fù)合體共同作用，賦予生精上皮細(xì)胞極性[30-31]，參與生精細(xì)胞遷移，在生精細(xì)胞遷移過程中起導(dǎo)向作用，從而保證生精細(xì)胞在生精小管內(nèi)遷移方向的正確性[32-33]。

三、血睪屏障與藥物運(yùn)輸

睪丸活體研究中發(fā)現(xiàn)，血睪屏障組成中存在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體及幾種生物活性多肽。這些結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)血睪屏障的功能，促進(jìn)藥物通過血睪屏障，這些觀點(diǎn)可應(yīng)用于非激素類男性避孕藥adjudin（即1-（2，4-dichlorobenzyl）-1H-indazole-3-carbohydra-zide）的研究[34]。

（一）藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體

以男性避孕藥adjudin為例，血睪屏障對其生物利用度有顯著影響，阻礙了藥物從生精上皮的間質(zhì)間隙轉(zhuǎn)移到腺腔內(nèi)。這在很大程度上是由于支持細(xì)胞在血睪屏障存在強(qiáng)勢表達(dá)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要為ATP結(jié)合盒（ATP Binding Cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體，如P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1），它們存在于支持細(xì)胞、生殖細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞以及構(gòu)成間質(zhì)微血管的內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜上[1,35-36]。此外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體中的乳腺癌耐藥蛋白（Breast Cancer Resistance Protein，BCRP）在固有層的管周肌樣細(xì)胞和間質(zhì)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有很強(qiáng)的表達(dá)[35-36]。這些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體均具有外排藥物的作用，并且彼此之間協(xié)同工作。如果外源性藥物以某種方式通過特定的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體（如藥物流入泵）穿透血睪屏障，它們就會積極地將外源性藥物從睪丸中泵出，阻止藥物進(jìn)入生精上皮，從而限制藥物在睪丸中的生物利用度。因此，可以在當(dāng)前研究的基礎(chǔ)上開發(fā)出針對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的制劑，減少藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的“外泵”作用，從而擴(kuò)大藥物療效。

（二）內(nèi)源性生物活性肽及其下游信號蛋白

在精子發(fā)生過程中通過對頂端胞質(zhì)特化和基底膜的組成蛋白水解產(chǎn)生幾種生物活性多肽，這些多肽可以通過下游信號蛋白有效地調(diào)節(jié)血睪屏障的功能，促進(jìn)男性避孕藥通過血睪屏障的運(yùn)輸。

第一個是來源于層粘連蛋白-γ3的F5肽[37-38]。F5肽通過干擾支持細(xì)胞在血睪屏障上的粘附功能來誘導(dǎo)血睪屏障的重塑[37]，還加強(qiáng)了頂端胞質(zhì)特化的分解，以促進(jìn)精子在受精過程中的釋放[37-38]。

第二個生物活性肽是NC1（noncollagenous 1）肽，NC1肽通過mTORC1（manmalian torget of rapamycin complex 1）和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)核糖體蛋白S6（即rpS6）[39]以及抑制Akt1/2（類似于蛋白激梅B）[40]的作用來發(fā)揮其功能，從而擾亂纖維肌動蛋白和微管的組織，加速基底胞質(zhì)特化及頂端胞質(zhì)特化的退變和重構(gòu)[40]。

第三個可以調(diào)節(jié)血睪屏障功能和頂端胞質(zhì)特化功能的生物活性肽是層粘連蛋白球狀域3/4/5（Lg3/4/5）肽，研究表明，Lg3/4/5肽與NC1肽類似，通過mTORC1/rpS6/Akt1/2信號復(fù)合體發(fā)揮下游作用[41]。

這三種生物活性肽的聯(lián)合作用使生精上皮中的胞質(zhì)特化具有可塑性，促進(jìn)生精上皮中發(fā)育的生殖細(xì)胞在生精上皮周期中及時運(yùn)輸，并調(diào)節(jié)血睪屏障的結(jié)構(gòu)和功能。

四、男性避孕藥的最新進(jìn)展

目前，有幾個候選化合物正在被研究者們積極研究，其中adjudin和加馬達(dá)唑似乎是兩個很有前景的先導(dǎo)化合物[42]。這兩種藥物都是氯硝胺的衍生物，已知通過破壞生殖細(xì)胞（大鼠睪丸中的第8-19步精子細(xì)胞）和支持細(xì)胞之間的睪丸特異性非典型粘附連接，即頂端胞質(zhì)特化，可誘導(dǎo)生精細(xì)胞可逆性脫落[43]。根據(jù)一項(xiàng)使用adjudin的研究，在雄性大鼠口服adjudin后，只有不到1%的adjudin可以到達(dá)睪丸[44]，顯示出相對較差的生物利用度，跨血睪屏障運(yùn)輸藥物的新發(fā)展將有助于開發(fā)出新型的非激素類避孕藥。

（一）細(xì)胞旁入路途徑

細(xì)胞旁途徑指特定物質(zhì)通過細(xì)胞之間的緊密連接進(jìn)入細(xì)胞間隙而被吸收的過程[45]。通過該途徑增加藥物吸收的研究已取得較大的進(jìn)展。小干擾RNA（Small Interfering RNA，siRNA）、中鏈脂肪酸、抗體和多肽等試劑均顯示了良好的調(diào)節(jié)效果[37,46-47]。據(jù)報道，許多多肽通過靶向支持細(xì)胞整合膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域來干擾緊密連接的通透性功能。例如，與大鼠Occludin蛋白的第二細(xì)胞外環(huán)的一段序列相對應(yīng)的22個氨基酸的肽，已知能在體外和/或體內(nèi)誘導(dǎo)支持細(xì)胞緊密連接屏障的可逆性破壞[48]。

來自層粘連蛋白-γ3鏈的、被命名為F5肽的生物活性多肽，在睪丸內(nèi)注射時也能對血睪屏障發(fā)揮作用，并加強(qiáng)頂端胞質(zhì)特化的破壞，從而有效地誘導(dǎo)生殖細(xì)胞脫落[37]。F5肽與adjudin聯(lián)合使用，這種方法可以顯著降低adjudin的有效劑量，以提高其生物利用度，該藥物在血睪屏障背后發(fā)揮避孕作用。更重要的是，F(xiàn)5肽在體外和體內(nèi)對血睪屏障的破壞性影響是可逆的，其長期健康風(fēng)險應(yīng)該是最小的，因?yàn)檫@是一種內(nèi)源性產(chǎn)生的生物分子[49]。研究表明使用該方法后，大鼠40天足以恢復(fù)生育能力[49]。

此外，通過下調(diào)緊密連接的整合膜蛋白（如ZO-1、occludin和claudin）的表達(dá)來調(diào)節(jié)血睪屏障通透性。使用特異性siRNA或短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）來提高藥物生物利用度，似乎是一種可行的方法。研究表明，在對claudin-5進(jìn)行siRNA修飾后的[48]小時內(nèi)，小鼠血腦屏障被短暫和可逆性打開；通過一系列示蹤分子實(shí)驗(yàn)和磁共振成像（MRI），雖然敲除claudin-5會損害血腦屏障的功能，允許小分子物質(zhì)透過，但屏障仍然可以形成，大分子的抗精子抗體依舊難以通過，完全發(fā)育的成年小鼠沒有顯示出明顯的副作用[50]。因此在未來的研究中可考慮男性避孕藥與siRNA鏈結(jié)合的給藥方法在血睪屏障中發(fā)揮作用。

（二）跨細(xì)胞方法

此方法主要是通過增加細(xì)胞對藥物分子的攝取，從而跨過組織屏障提高生物利用率，具體包括以下幾種方法：

1.微粉化技術(shù)是最廣泛使用的方法，它大大減小了藥物顆粒的大小，使藥物可以很容易地穿透靶器官的細(xì)胞膜。過去十年中超臨界流體（SCF）技術(shù)被廣泛研究。早期的超臨界流體技術(shù)用于生產(chǎn)粒徑約0.7-5.0μm的顆粒。最近的SCF能夠獲得納米級的藥物顆粒，例如“粒徑”＜300nm，從而顯著提高不同藥物的溶解度和口服生物利用度[51]。使用SCF-CO2方法，可以生產(chǎn)更穩(wěn)定、更均勻的脂質(zhì)體，作為更好的藥物載體[52]，未來可將幾乎不溶于水的adjudin包埋在脂質(zhì)體中，或利用超臨界流體技術(shù)制備均勻細(xì)小的adjudin微粒，以提高其生物利用度和有效性。

2.反式轉(zhuǎn)錄激活因子（TAT）序列，本質(zhì)是一種11個氨基酸的肽，稱為蛋白質(zhì)/肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（Protein/Peptide Transduction Domain，PTD），也被稱為細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）[53-54]。目前研究認(rèn)為，藥物可通過PTD結(jié)合到質(zhì)膜上，然后通過胞內(nèi)囊泡介導(dǎo)的內(nèi)化，將藥物釋放到細(xì)胞胞漿內(nèi)[54]，類似于血睪屏障中的內(nèi)吞囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)事件。簡而言之，adjudin或其他男性避孕藥結(jié)合PTD是男性避孕藥跨越血睪屏障的一種新的替代方法。

3.此外，納米技術(shù)的發(fā)展也為男性避孕藥通過血睪屏障帶了曙光。納米粒子的粒徑在1～1000 nm，已被廣泛運(yùn)用于輸送多種治療藥物，主要作為抗癌藥物的載體。傳統(tǒng)的藥物分子要么連接到納米粒子的表面，要么包裹到納米核心中，被運(yùn)送到靶器官以提高療效。這些納米粒子主要設(shè)計用來運(yùn)輸水溶性低或容易被酶分解的藥物[55]。納米粒子通常由脂類、金屬材料、聚合物、納米晶體、介孔材料等組成。其中，介孔材料正在成為男性避孕藥物的新興載體。其中研究最多的是介孔二氧化硅納米粒子（Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN）[56]。MSN通過胞內(nèi)囊泡介導(dǎo)的途徑[57]或GTP酶介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入細(xì)胞[58]。給小鼠睪丸靜脈注射無定形納米二氧化硅顆粒，被證明可以穿透支氣管束，并導(dǎo)致支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞（例如，精母細(xì)胞）中納米顆粒的積累，而不會造成睪丸損傷[59]。此外，還可以使生物活性藥物在到達(dá)靶細(xì)胞/組織之前不會被酶降解，因?yàn)槠浔砻娌荒鼙惑w循環(huán)和組織（例如腸道）中的酶所利用[60]。因此，男性避孕藥有可能被加載到MSN的六邊形排列的中孔中，以供口服，而不需要使用注射，避免了腸外給藥，提高了可接受性。

五、總結(jié)和展望

我們總結(jié)了血睪屏障的相關(guān)結(jié)構(gòu)組成和生物學(xué)功能，并討論了非激素男性避孕藥如何更好穿越血睪屏障，如藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、生物活性肽以及跨越血睪屏障的新技術(shù)，如siRNA和納米顆粒運(yùn)輸?shù)?，這些方法在減少藥物副作用和提高藥物生物利用度方面都顯示出明顯的優(yōu)勢。

然而，男性避孕藥的臨床研發(fā)和推廣目前仍存在部分挑戰(zhàn)。例如，對于不同種族、不同年齡的男性對同一種避孕藥的反應(yīng)是否完全相同；服用避孕藥之后的男性停藥后是否能夠迅速且完全地恢復(fù)生育能力；如何安全有效地在臨床上進(jìn)行藥物試驗(yàn)。同樣的，在保證藥物安全有效的前提下，我們?nèi)孕枰ＷC藥物成本控制在大眾可接受范圍之內(nèi)。盡管在未來還有很多問題需要很多研究，但血睪屏障的進(jìn)展已經(jīng)為開發(fā)新的睪丸給藥方法帶來了新的曙光。

關(guān)鍵詞血睪屏障； 避孕藥，男用； 藥物釋放系統(tǒng)；納米技術(shù)

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2022.02.020

中圖分類號R339.211； R698.9； R979.21