小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1表達(dá)及臨床意義*

彭潛龍 田 穩(wěn) 李創(chuàng)業(yè) 聶有能 趙夭望

湖南省兒童醫(yī)院 泌尿外科（湖南 410000）

尿道下裂（Hypospadias）是由于前尿道發(fā)育異常，尿道開(kāi)口達(dá)不到正常位置，是小兒泌尿生殖系統(tǒng)疾病最常見(jiàn)的畸形之一，常伴有陰莖短小、下彎，使患兒不能站立排尿，甚至影響患兒成年后性功能和生育能力，嚴(yán)重影響患兒的身心健康。尿道下裂唯一的治療方法是手術(shù)矯正，但伴有較高的并發(fā)癥發(fā)生率，近年來(lái)，尿道下裂發(fā)病率高達(dá)0.4%，且仍有上升的趨勢(shì)，抗雄激素物質(zhì)或雌激素是導(dǎo)致尿道下裂的一個(gè)重要原因[1,2]。因此，尋找與小兒尿道下裂有關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)改善患兒生活質(zhì)量具有重要意義。環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是一種誘導(dǎo)酶，正常生理情況下處于不表達(dá)或低表達(dá)，但在一些病理情況下高表達(dá)，大量研究表明，在細(xì)胞受到炎癥因子、化學(xué)藥物、癌基因等刺激時(shí)COX-2被迅速合成，從而參與炎癥反應(yīng)、組織損傷、腫瘤的發(fā)生等，此外有研究報(bào)道，孕激素可刺激COX-2高表達(dá)，隨后COX-2誘導(dǎo)合成過(guò)量雌激素，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[3,4]。但關(guān)于COX-2在尿道下裂患兒包皮組織中的表達(dá)情況研究較少。金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP1）為基質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的 天然抑制劑，MMPs在人體內(nèi)廣泛分布，參與血管形成、胎膜破裂、胚泡植入、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)、內(nèi)分泌失調(diào)等病理生理過(guò)程。TIMP1能夠和MMPs特異性結(jié)合，阻斷MMPs激活過(guò)程，阻礙MMPs與底物結(jié)合，抑制MMPs發(fā)揮降解作用，從而使睪酮等分泌異常，使機(jī)體內(nèi)分泌紊亂動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，從而引發(fā)一系列病理生理變化[5,6]。但是關(guān)于TIMP1在尿道下裂患兒包皮組織中的表達(dá)方面的研究較少，本研究采用免疫組化法檢COX-2、TIMP1在小兒尿道下裂患者包皮組織中的表達(dá)情況，并探討其與小兒尿道下裂之間的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2020年6月至2021年6月在我院泌尿外科收治的小兒尿道下裂患者151例為尿道下裂組，年齡5～11歲，平均年齡（6.91±1.62）歲；另選取71例尿道外口正常者為正常對(duì)照組，年齡4～12歲，平均年齡（7.48±1.59）歲；根據(jù)陰莖伸直后尿道外口位置將尿道下裂組患兒分為輕型組48例（陰莖遠(yuǎn)側(cè)型、冠狀溝型、陰莖頭型）、中型組50例（后2/3陰莖干型）、重型組53例（會(huì)陰型、陰囊型、陰莖陰囊型）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床上通過(guò)典型的臨床表現(xiàn)和泌尿系的B超檢查等確診為尿道下裂；②無(wú)手術(shù)矯正史；③無(wú)兩性畸形或者其他系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并尿道下裂以外的生殖器畸形；②合并其他器官的畸形和內(nèi)分泌的異常；③臨床資料不全。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：HCHLL-2020-47），所有受試者及其監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書(shū)。

二、主要試劑與儀器

兔抗人COX-2、TIMP1抗體、羊抗兔IgG均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色劑購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；顯微圖像采集系統(tǒng)購(gòu)自Nikon生物顯微鏡&SPOT成像系統(tǒng)，石蠟切片機(jī)購(gòu)自英國(guó)SHANDON公司，雙目光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司，分光光度儀購(gòu)自美國(guó)GretagMacbeth公司。

三、標(biāo)本采集

取小兒尿道下裂患者手術(shù)后留取的包皮組織，同時(shí)留取陰莖發(fā)育正常包皮環(huán)切手術(shù)者的包皮組織，分別標(biāo)記后放于-80℃中保存，待測(cè)。

四、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中COX-2、TIMP1表達(dá)

取出標(biāo)本并進(jìn)行切片，處理后分別滴加兔抗人COX-2（1:400）、TIMP1（1：400）抗體作為一抗，4℃過(guò)夜，用PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1:1000），用PBS清洗3次，之后滴加DAB顯色進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，5-10min后用顯微鏡觀察染色情況，COX-2、TIMP1表達(dá)均為包皮組織真皮層纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)和/或胞膜，以細(xì)胞胞漿/胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。

五、結(jié)果判定

使用光學(xué)顯微鏡觀察，分別對(duì)和正常對(duì)照組中每張切片隨機(jī)挑選并對(duì)COX-2、TIMP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。①根據(jù)陽(yáng)性百分率＜6%為0分、7%～29%為1分、29%～49%為2分、49%以上為3分。②根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無(wú)著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色，③根據(jù)二者乘積得到總分：≤3分為陰性（-），3～5分為弱陽(yáng)性（+）；6～8分為中度陽(yáng)性（++）；9～10分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），+～+++均為陽(yáng)性表達(dá)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]進(jìn)行描述，三組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman法分析小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1的相關(guān)性，Logistic回歸分析與尿道下裂發(fā)生的有關(guān)因素，以P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、COX-2、TIMP1在正常對(duì)照組和小兒尿道下裂患者的表達(dá)情況比較

正常對(duì)照組包皮組織COX-2表達(dá)陽(yáng)性19例，陰性52例，尿道下裂患者包皮組織COX-2表達(dá)陽(yáng)性121例，陰性30例，小兒尿道下裂患者中包皮組織COX-2的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；正常對(duì)照組包皮組織TIMP1表達(dá)陽(yáng)性48例，陰性23例，尿道下裂患者包皮組織表達(dá)陽(yáng)性38例，陰性113例。小兒尿道下裂患者中包皮組織TIMP1的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常對(duì)照組（P＜0.05），詳見(jiàn)表1，圖1。

表1 COX-2在正常對(duì)照組和小兒尿道下裂患者的表達(dá)情況比較

圖1 免疫組化圖

二、不同程度小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1的表達(dá)情況比較

小兒尿道下裂患者中包皮組織COX-2的陽(yáng)性表達(dá)率：重型組＞中型組＞輕型組（P＜0.05），TIMP1的陽(yáng)性表達(dá)率：輕型組＞中型組＞重型組（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 COX-2在正常對(duì)照組和小兒尿道下裂患者的表達(dá)情況比較

三、小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2、TIMP1的相關(guān)性

小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2與TIMP1的表達(dá)有關(guān)（r=-0.514，P＜0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2、TIMP1的相關(guān)性

四、二元Logistic回歸分析小兒尿道下裂影響因素

將是否發(fā)生小兒尿道下裂作為因變量，以雌二醇、睪酮、包皮組織COX-2、TIMP1陽(yáng)性表達(dá)作為水平自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示雌二醇、睪酮、COX-2、TIMP1水平與小兒尿道下裂的發(fā)生有關(guān)（P＜0.05），詳見(jiàn)表4。

表4 尿道下裂的影響因素分析

討 論

尿道下裂是兒童較為常見(jiàn)的泌尿生殖道先天畸形，約占新生男嬰的0.3%-0.5%，僅次于先天性心臟病，且近年來(lái)仍然呈上升趨勢(shì)，尿道下裂的病因涉及遺傳因素、環(huán)境因素、激素調(diào)控、基因突變等，妊娠早期母體接觸農(nóng)藥、輻射、吸煙（被動(dòng)）等都可能會(huì)增加尿道下裂的發(fā)生率。尿道下裂的病因和發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前僅有低于5%的患兒能找到確切的發(fā)病原因，但對(duì)于大多數(shù)的尿道下裂患兒的病因仍然不是很了解，因此，尋找與小兒尿道下裂有關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)改善患兒生活質(zhì)量具有重要意義[7,8]。

COX-2是經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子等誘導(dǎo)下表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Cox-2在多種癌組織，如子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌呈高表達(dá)[9,10]。Ellen[11]等詳細(xì)介紹了COX-2在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域中的作用，在內(nèi)膜異位癥患者腺上皮中COX-2的表達(dá)高于正常婦女，提示COX-2的表達(dá)與內(nèi)膜異位的發(fā)生有關(guān)。梁金紅[12]研究結(jié)果表明，COX-2子宮內(nèi)膜癌中呈高表達(dá)，提示COX-2在子宮內(nèi)膜癌的病理生理過(guò)程中起重要作用。楊勇波[13]等研究結(jié)果表明，宮頸癌組織中COX-2呈高表達(dá)，且與化療敏感性密切相關(guān)，可用于宮頸癌病人新輔助化療治療前化療敏感性的預(yù)測(cè)。妊娠早期母體的雌激素干預(yù)可引發(fā)胎兒發(fā)生先天性尿道下裂，COX-2可能參與了雌激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其與小兒尿道下裂的發(fā)生有關(guān)[7]，本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，小兒患者COX-2陽(yáng)性表達(dá)率升高，且COX-2陽(yáng)性表達(dá)率隨小兒尿道下裂患者病情的加重而升高，提示COX-2可能在尿道下裂的發(fā)生中發(fā)揮一定的作用，與尿道下裂的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，推測(cè)COX-2表達(dá)可能誘導(dǎo)雌激素分泌，通過(guò)介導(dǎo)雌激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了小兒尿道下裂的發(fā)生發(fā)展過(guò)程；多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明COX-2是小兒尿道下裂患者發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示COX-2可能與尿道下裂的發(fā)生具有一定的關(guān)系。

TIMP-1是一種相對(duì)分子質(zhì)量28000的糖蛋白，能夠與活化的間質(zhì)膠質(zhì)酶、間質(zhì)溶解素、MMP-9以非共價(jià)鍵形成復(fù)合物，抑制酶原的活化[14]。周琦[15]等研究結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥組織中TIMP-1與侵襲程度呈負(fù)相關(guān)，TIMP-1隨著子宮內(nèi)膜異位癥臨床分期的升髙而降低，提示人工誘導(dǎo)TIMP-1表達(dá)可能抑制內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。滿(mǎn)冬梅[16]等研究結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中TIMP-1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達(dá)上調(diào)，TIMP-1降低了對(duì)MMP-9的抑制作用，從而使異位內(nèi)膜細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力以及異位種植能力，提示TIMP-1、MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起極其重要的作用。尿道下裂由于胎兒內(nèi)分泌紊亂主要是雙氫睪酮和睪酮的分泌紊亂而發(fā)生疾病，TIMP-1的異常表達(dá)可能是一種繼發(fā)性改變從而致使小兒尿道異位形成尿道下裂[7]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，小兒尿道下裂患者TIMP1陽(yáng)性表達(dá)率降低，且TIMP1陽(yáng)性表達(dá)率隨小兒尿道下裂患者病情的加重而降低，提示TIMP1能反映小兒尿道下裂患者病情的嚴(yán)重程度，推測(cè)TIMP-1低表達(dá)可能減少了對(duì)MMP的激活，無(wú)法降解睪酮等激素，使機(jī)體睪酮等激素水平異常發(fā)生內(nèi)分泌紊亂平衡失調(diào)，從而參與小兒尿道下裂的發(fā)生發(fā)展過(guò)程；經(jīng)Pearson法分析小兒尿道下裂患者COX-2、TIMP1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示COX-2、TIMP1可能共同參與疾病發(fā)生發(fā)展，多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明TIMP1是小兒尿道下裂患者發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示TIMP1的異常表達(dá)可能在尿道下裂發(fā)展演變存在一定關(guān)系。

綜上所述，COX-2、TIMP1表達(dá)情況可能與尿道下裂的發(fā)生發(fā)展演變有關(guān)，有望成為尿道下裂潛在的研究靶點(diǎn)。