基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討冠心2號(hào)方治療冠心病的作用機(jī)制

劉振飛，劉 爽，張世亮

冠心病(coronary heart disease，CHD)是一種常見的慢性心血管系統(tǒng)疾病，好發(fā)于老年人，近年來患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。我國(guó)CHD患病人數(shù)每年以20%的平均速度遞增，CHD病死率占所有典型心血管疾病死亡病例總數(shù)的10 %～20 %[4]。CHD在中醫(yī)上歸于“胸痹”范疇，其病位主要在心，病理因素可有寒凝、痰濁、血瘀等[2]，其中又以血瘀最為多見[3]。在治療CHD方面，中藥具有多通路、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，在臨床中療效顯著[5]。冠心2號(hào)方由丹參、紅花、赤芍、川芎、降香5味藥組成，具有活血化瘀之功，中華中醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)發(fā)布的《冠心病穩(wěn)定型心絞痛中醫(yī)診療指南》[6]提出治療心血瘀阻型冠心病心絞痛首選冠心2號(hào)方。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在藥物分子水平上構(gòu)建“藥物-成分-疾病”的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。其整體性與系統(tǒng)性與中醫(yī)藥研究的整體觀與辨證論治相契合[7-8]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)治療心力衰竭、CHD、糖尿病等多種疾病的中藥復(fù)方、單味藥及藥對(duì)作用進(jìn)行了研究[9-11]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析研究冠心2號(hào)方在治療CHD的作用機(jī)制，為冠心2號(hào)方在臨床的應(yīng)用研究提供新的理論思路與方法。

1 資料與方法

1.1 冠心2號(hào)方活性成分的獲取與篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php)中分別錄入丹參、紅花、赤芍、川芎、降香進(jìn)行檢索，根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18條件選出有效成分，并且獲取成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。然后將導(dǎo)出的靶點(diǎn)直接導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.unitprot.org/)進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 CHD疾病靶點(diǎn)的獲取與預(yù)測(cè) 在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中以“coronary heart disease”進(jìn)行檢索，將檢索到的蛋白名稱復(fù)制到UniProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到CHD的靶點(diǎn)信息，共有949個(gè)。

1.3 冠心2號(hào)方活性成分與疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將冠心2號(hào)方的成分靶點(diǎn)與CHD的靶點(diǎn)取交集，尋找兩者的共同靶點(diǎn)，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，組建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 將冠心2號(hào)方與CHD的共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為智人，構(gòu)建“冠心2號(hào)方-CHD靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Network Analyzer進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度(Degree)≥38進(jìn)行篩選，得到冠心2號(hào)方治療CHD的核心靶點(diǎn)。

1.5 生物通路及富集分析 利用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)冠心2號(hào)方治療CHD的共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析。將上述共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID，物種設(shè)置為智人，進(jìn)行分析，通過通路富集結(jié)果對(duì)冠心2號(hào)方治療CHD的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 分子對(duì)接 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載冠心2號(hào)方活性成分化合物的3D結(jié)構(gòu)。通過PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www1.rcsb.org/)下載目的靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，利用AutoDock 1.5.6對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行除氫、去水、去除小分子配體等操作，將化合物和蛋白進(jìn)行蛋白-分子對(duì)接，其結(jié)果以結(jié)合自由能的高低作為與化合物結(jié)合程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，使用Pymol 2.5軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié) 果

2.1 冠心2號(hào)方活性成分的靶點(diǎn)篩選及預(yù)測(cè) 通過TCMSP篩選獲得冠心2號(hào)方有效成分160個(gè)，其中丹參最多，65個(gè)；降香次之， 37個(gè)；紅花22個(gè)；赤芍29個(gè)；川芎最少，7個(gè)。具體活性成分見表1。

表1 冠心2號(hào)方有效成分

(續(xù)表)

(續(xù)表)

(續(xù)表)

2.2 冠心2號(hào)方成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將冠心2號(hào)方的有效成分作用靶點(diǎn)與CHD的靶點(diǎn)取交集，通過網(wǎng)絡(luò)合并，獲得冠心2號(hào)方和CHD的共有靶點(diǎn)74個(gè)(見圖1)。利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。網(wǎng)絡(luò)圖中共有節(jié)點(diǎn)204個(gè)，紅色“V”形代表疾病CHD，綠色六邊形代表中藥丹參、紅花、赤芍、川芎、降香，淺藍(lán)色菱形代表冠心2號(hào)方中有效成分共124節(jié)點(diǎn)，深藍(lán)色圓形代表冠心2號(hào)方與CHD共有的靶點(diǎn)共74節(jié)點(diǎn)，其中最大自由度111，最小自由度為2，平均自由度為13.37。槲皮素、山奈酚、木犀草素、黃芩素、β-谷甾醇度值最高，說明其在治療冠心病中發(fā)揮主要作用。

圖1 冠心2號(hào)方治療CHD的藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 冠心2號(hào)方治療CHD的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(DS為丹參，JX為降香，CS為赤芍，HH為紅花，CX為川芎)

2.3 核心靶點(diǎn)的篩選 將冠心2號(hào)方與CHD的74個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫建立“冠心2號(hào)方-CHD”靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3，共得到74個(gè)節(jié)點(diǎn)、833條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為22.5；再將該結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，通過Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以藍(lán)色圓形代表共同靶點(diǎn)，Degree值越大，圓形越大。以Degree值≥38為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到17個(gè)核心靶點(diǎn)，見表2，并一起構(gòu)成核心網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)藍(lán)色越深、面積越大，代表Degree值越大，該靶點(diǎn)自由度越高。邊顏色越深，寬度越大，證明兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間聯(lián)系越緊密，見圖4。

表2 冠心2號(hào)方治療CHD的核心靶點(diǎn)

圖3 冠心2號(hào)方治療CHD的“成分-疾病”靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 冠心2號(hào)方治療CHD的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 生物通路及富集分析 將冠心2號(hào)方治療CHD的PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的17個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，共獲得93條基因本體(GO)條目(P<0.05)，其中生物途徑(biological process，BP)62條，細(xì)胞定位(cell component，CC)11條，分子功能(molecular function，MF)20條。包括一氧化氮(NO)生物合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)等。將GO條目中的信息利用Omicshare平臺(tái)構(gòu)建高級(jí)氣泡圖，見圖5。京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集信號(hào)通路74條(P<0.05)，包括NOD樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。選取前20名信息通路，詳見表3。

圖5 冠心2號(hào)方治療CHD的GO功能富集分析圖

表3 冠心2號(hào)方治療CHD的KEGG功能富集信號(hào)通路

(續(xù)表)

2.5 分子對(duì)接分析 將冠心2號(hào)方作用靶點(diǎn)較多的前兩位成分槲皮素、山奈酚與核心靶點(diǎn)蛋白Degree值前兩位IL-6及VEGFA分別進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)合，結(jié)果如表4所示，一般而言，結(jié)合能<-20.9 kJ/mol說明可形成穩(wěn)定的對(duì)接結(jié)構(gòu)，使用Pymol 2.5軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果可視化，觀察結(jié)合位點(diǎn)名稱及兩結(jié)合位點(diǎn)之間的距離。詳見圖6、圖7。

表4 冠心2號(hào)方治療CHD的主要活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能 單位：kJ/mol

圖6 槲皮素與IL-6、槲皮素與VEGFA的分子對(duì)接3D模式圖

圖7 山奈酚與IL-6、山奈酚與VEGFA的分子對(duì)接3D模式圖

3 討 論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫找到冠心2號(hào)方的活性化學(xué)成分160個(gè)，與CHD交集靶點(diǎn)74個(gè)，GO富集分析條目93條，KEGG富集分析得到信號(hào)通路74條。溫昭君[12]在進(jìn)行了85例臨床觀察后發(fā)現(xiàn)，冠心2號(hào)方治療CHD療效較好，且相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組不良反應(yīng)較少。李黔云等[13]進(jìn)行108例CHD穩(wěn)定型心絞痛的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)冠心2號(hào)方能明顯改善冠心病病人的癥狀、體征、心電圖，提高生活質(zhì)量。從冠心2號(hào)方的活性成分分析，度值最高的前5位分別為紅花中的槲皮素、山奈酚，丹參和紅花中共有的木犀草素，赤芍和紅花中共有的黃芩素，赤芍、紅花及降香中共有的β-谷甾醇。槲皮素、木犀草素、黃芩素、山奈酚都屬于黃酮類化合物。槲皮素具有抗氧化、抗炎癥、保護(hù)心血管等作用，其通過減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和下調(diào)活性氧介導(dǎo)的下游信號(hào)通路等方式發(fā)揮作用[14]。槲皮素進(jìn)行抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制可能是通過下調(diào)高遷移率族蛋白1(HMGB1)、Toll樣受體4(TLR4)的蛋白和基因表達(dá)，并且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性[15]。山奈酚可通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[16]。木犀草素可以預(yù)防心血管疾病的發(fā)生，機(jī)制為改善較高的血壓狀態(tài)和膽固醇含量[17]。黃芩素化學(xué)名稱為5，6，7-三羥基黃酮，與木犀草素相同都由降壓作用，同時(shí)又具有擴(kuò)張血管、心肌保護(hù)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞以及抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理活性，從而達(dá)到血管保護(hù)的作用[18]。β-谷甾醇屬于植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[19]，研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能明顯降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白的水平[20]，降低動(dòng)脈硬化指數(shù)[21]，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈硬化作用。通過對(duì)冠心2號(hào)方有效成分的分析發(fā)現(xiàn)，冠心2號(hào)方通過降壓、降脂、抗炎、抗氧化等多種途徑來治療CHD，具有多途徑的特點(diǎn)。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，得到與CHD交集自由度較高的靶點(diǎn)有IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1。IL6是其基因轉(zhuǎn)錄的一種多功能細(xì)胞因子，包含184個(gè)氨基酸，其在機(jī)體病理和生理活動(dòng)中發(fā)揮多種作用，例如急性炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和腫瘤形成[22]。VEGFA廣泛存在于人的心、腦、骨骼等器官中，能夠促進(jìn)新生血管的形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能夠改善心肌重塑，保護(hù)存活心肌細(xì)胞[23]。TNF是可以損傷腫瘤細(xì)胞且使其壞死的物質(zhì)，TNF最重要的是對(duì)腫瘤的作用，同時(shí)也對(duì)心血管疾病有著重要的治療意義，并且VEGF須依靠TNF-α才能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮高度滲透性的狀態(tài)[24]。TP53屬于腫瘤抑制因子，能夠抑制腫瘤的產(chǎn)生與生長(zhǎng)，其機(jī)制為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。同時(shí)在細(xì)胞自噬及葡萄糖代謝中也發(fā)揮重要作用[25]。MAPK1又稱為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2，在細(xì)胞的炎癥性反應(yīng)、生長(zhǎng)、分化、增殖和生存等生理過程中有重要調(diào)控作用[26]。

GO富集結(jié)果顯示，在BP過程富集條目主要為NO生物合成過程的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對(duì)脂多糖(LPS)的細(xì)胞反應(yīng)。NO由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，有維護(hù)血管正常收縮的功能，當(dāng)NO分泌不足或過多時(shí)，會(huì)出現(xiàn)血管舒縮異常的癥狀，從而引起冠心病的發(fā)生與促進(jìn)冠心病的發(fā)展[27]。VSMCs增殖是動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理改變，PDGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血栓素A2、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、極低密度脂蛋白都可使VSMCs增殖，在冠心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[28]。脂多糖是冠心病機(jī)制性生物學(xué)標(biāo)志物，能夠引導(dǎo)形成泡沫細(xì)胞并促進(jìn)膽固醇酯在低密度脂蛋白中的累積，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，脂多糖濃度越高，動(dòng)脈內(nèi)膜厚度越厚[29-30]。由此推測(cè)，冠心2號(hào)方可能通過增加NO分泌，減少平滑肌增殖，減少脂多糖等途徑來治療冠心病。

從KEGG富集分析結(jié)果可知，在治療過程中涉及的通路主要有NOD樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。張曉林[31]在研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟缺血再灌注損傷中可激活NOD2信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥途徑導(dǎo)致急性腎損傷，予NADPH氧化酶抑制劑抑制氧化應(yīng)激后可阻斷NOD2樣受體依賴的炎癥途徑以減輕腎臟缺血再灌注損傷。TNF介導(dǎo)的信號(hào)通路具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和誘導(dǎo)炎癥的作用[32]。雌激素具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，其過程與抑制PERK信號(hào)通路引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的過程有關(guān)[33]。由此推測(cè)冠心2號(hào)方可能通過減輕炎癥反應(yīng)，以及減少細(xì)胞凋亡來保護(hù)血管內(nèi)皮，從而達(dá)到治療冠心病的目的，說明冠心2號(hào)方治療CHD的路徑較多，機(jī)制相對(duì)較為復(fù)雜，同時(shí)也提示該生物過程將會(huì)是未來研究冠心2號(hào)方治療CHD的方向。

采用分子對(duì)接技術(shù)將槲皮素、山奈酚與核心靶點(diǎn)蛋白IL6及VEGFA分別進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)合，進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚與IL6及VEGFA成分與有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且結(jié)合較為穩(wěn)定。冠心2號(hào)方在治療CHD方面具有多通路、多靶點(diǎn)、多成分的特點(diǎn)，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)發(fā)掘預(yù)測(cè)并優(yōu)選冠心2號(hào)方有效成分及其作用靶點(diǎn)，構(gòu)建可視化“成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”多層次、多維度網(wǎng)絡(luò)圖，明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，深入探究其治病機(jī)制，闡明其靶點(diǎn)作用通路，為冠心2號(hào)方后續(xù)的處方優(yōu)化及藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供參考。同時(shí)也為其他復(fù)方中藥的研究提供思路與方法，促進(jìn)現(xiàn)代中醫(yī)藥發(fā)展及新藥的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新。