生長(zhǎng)季不同月份平茬對(duì)檸條人工林地土壤細(xì)菌群落特性的影響

田英 ，許喆 ，朱麗珍 ，2，王俊 ，溫學(xué)飛

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏林業(yè)研究院，寧夏 銀川 750004；3. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，寧夏 銀川 750002；4. 寧夏防沙治沙與水土保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750002）

寧夏東部典型荒漠草原地處干旱與半干旱農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，生態(tài)環(huán)境脆弱，是寧夏重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，也是我國(guó)西北地區(qū)重要的生態(tài)建設(shè)區(qū)域。檸條（Caragana intermedia）是豆科（Leguminosae）錦雞兒屬（Caragana）植物栽培種的通稱(chēng)，其根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)，是荒漠草原地帶典型的旱生植物［1-2］。我國(guó)實(shí)施退耕還林（草）工程以來(lái)，西北、華北、東北等地水土保持和固沙造林大面積人工種植檸條，取得了良好的防風(fēng)固沙、水土保持、植被恢復(fù)生態(tài)效益［3］。檸條還具有良好的飼用價(jià)值。但是，隨著林齡的增加，早期種植的檸條出現(xiàn)了不同程度的木質(zhì)化，甚至死亡現(xiàn)象，必須進(jìn)行平茬。平茬能夠促進(jìn)植株伐樁基部萌發(fā)大量枝條，發(fā)揮生殖補(bǔ)償能力，促進(jìn)檸條根系生長(zhǎng)和更新復(fù)壯［4-5］，是解決檸條早衰死亡的一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)而有效的措施。有關(guān)檸條平茬的研究報(bào)道多集中在平茬措施對(duì)檸條的生長(zhǎng)、產(chǎn)量、飼料營(yíng)養(yǎng)成分、土壤水分與理化性質(zhì)、土壤結(jié)構(gòu)、林下植被多樣性與恢復(fù)程度的影響，以及平茬復(fù)壯更新技術(shù)和設(shè)施設(shè)備等方面，而且平茬對(duì)檸條自身生長(zhǎng)、土壤環(huán)境、植被多樣性恢復(fù)的有益效果已經(jīng)得到廣泛肯定［6-8］。在土壤微生物方面，研究主要集中在不同立地環(huán)境、土壤類(lèi)型、人工林種植密度對(duì)檸條林地土壤細(xì)菌、真菌等微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響等方面［9-11］，未見(jiàn)有關(guān)不同時(shí)間平茬檸條林地土壤微生物的研究報(bào)道。

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能類(lèi)群、土壤微生物與環(huán)境關(guān)系等研究越來(lái)越多［12-13］。Illumina 擴(kuò)增測(cè)序的16S rRNA 基因技術(shù)可以檢測(cè)出更高的微生物物種和多樣性。但在平茬、刈割等措施對(duì)土壤微生物的影響方面的研究報(bào)道并不多，僅在草地生態(tài)系統(tǒng)中刈割與不刈割、不同刈割高度下植物和土壤微生物之間相互關(guān)系方面有少數(shù)報(bào)道［14-17］。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異受到土地類(lèi)型、養(yǎng)分含量、營(yíng)造林措施、放牧、地上植被類(lèi)型及生長(zhǎng)等諸多環(huán)境因子和人為干擾的影響［18］。植物與環(huán)境是相互反饋的循環(huán)過(guò)程，平茬后檸條植株本身生長(zhǎng)的差異會(huì)通過(guò)根系生長(zhǎng)、分泌物釋放等反饋于土壤，最為敏感的土壤微生物也必然會(huì)對(duì)這些變化做出響應(yīng)［19］。因此，研究不同月份平茬對(duì)檸條人工林地土壤細(xì)菌的影響，對(duì)于評(píng)估檸條平茬的生態(tài)效果十分必要，同時(shí)也對(duì)研究人工林營(yíng)建與管理措施對(duì)土壤微生物的影響等土壤微生態(tài)學(xué)研究有著重要的理論和實(shí)際意義。本試驗(yàn)采用Illumina Hiseq 高通量測(cè)序法，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，分析檸條生長(zhǎng)季不同月份（4-10月）平茬對(duì)寧夏鹽池荒漠草原人工檸條林地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，同時(shí)也為豐富寧夏荒漠草原人工檸條林地土壤微生物生態(tài)學(xué)研究，以及科學(xué)認(rèn)識(shí)平茬對(duì)檸條人工林地土壤的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于寧夏吳忠市鹽池縣花馬池鎮(zhèn)柳楊堡村荒漠草原（37°50′ N，107°19′ E）。地處毛烏素沙地南緣，與陜西省、內(nèi)蒙古自治區(qū)接壤，是從沙地到荒漠草原到典型草原的過(guò)渡地帶，也是鄂爾多斯高原到黃土高原的過(guò)渡地帶，屬典型的中溫帶大陸性氣候，年均氣溫為7.6 ℃，年均降水量為290 mm，主要分布在7-9月，約占全年降水量的70%，年蒸發(fā)量為2132 mm，無(wú)霜期約162 d，年均風(fēng)速2.08 m·s-1。土壤類(lèi)型主要是灰鈣土、黑壚土和風(fēng)沙土，并伴有黃土和少量的鹽土［5］。植被以荒漠草原旱生和中旱生植物為主，主要草本植物有：白草（Pennisetum centrasiaticum）、蟲(chóng)實(shí)（Corispermum mongolicum）、賴(lài)草（Leymus secalinus）、狗尾草（Setaria viridis）、牛枝子（Lespedeza davurieca）、阿 爾 泰 狗 娃 花（Heteropappus altaicu）、蒺 藜（Tribulus terrestris）、草 木 樨 狀 黃 芪（Astragalus melilotoides）、披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）等［7］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)區(qū)種植的檸條具體品種是中間錦雞兒（C. intermedia），林齡25年。2017年選擇地勢(shì)較平坦、土壤、植被和生長(zhǎng)狀況一致的檸條人工灌木林及其林間草地作為研究樣地，樣地內(nèi)的檸條種植方式統(tǒng)一為兩行一帶，帶寬1 m，帶間距8 m。于當(dāng)年4-10月的每月中旬隨機(jī)選擇一帶進(jìn)行人工平茬，平茬方式為間隔平茬，隔一帶平一帶，留茬高度 5 cm，每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù)。4-10月不同月份平茬處理分別對(duì)應(yīng)編號(hào) Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10。于2018年8月中旬，對(duì)不同月份平茬后的檸條人工林地土壤進(jìn)行取樣，每個(gè)處理重復(fù)3 次，各采樣點(diǎn)距離50 m 以上，每個(gè)樣點(diǎn)按照5 點(diǎn)取樣法，取距離檸條植株5 cm 范圍內(nèi)0～30 cm 深度的土壤，四分法混合均勻后作為一個(gè)土壤樣品，共計(jì)21個(gè)樣品。將采集到的新鮮土樣分成兩份，一份立即去除植物根系、石塊等雜質(zhì)，過(guò)2 mm 篩后，用無(wú)菌土壤樣品分裝管進(jìn)行分裝，放入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于土壤微生物高通量測(cè)序總DNA 提取；另一份塑封袋保存，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干，經(jīng)過(guò)去雜過(guò)篩后避光保存，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

參照鮑士旦［20］和魯如坤的方法［21］，略有調(diào)整。其中，采用烘干法測(cè)定土壤含水量。采用水土比2.5∶1 懸液，pH 計(jì)（梅特勒FE28Standard，瑞士）測(cè)定pH；采用水土比5∶1 浸提液，電導(dǎo)率儀（梅特勒S30K，瑞士）測(cè)定全鹽含量；采用K2Cr2O7容量法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量；采用凱氏定氮法測(cè)定全氮含量；采用NaOH 堿溶-鉬銻抗比色法測(cè)定全磷含量；采用NaOH 熔融法-火焰光度計(jì)測(cè)定全鉀含量；采用NaOH 堿解法測(cè)定速效氮含量；采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷含量；采用醋酸銨浸提液-火焰光度計(jì)測(cè)定速效鉀含量。

1.4 土壤微生物總DNA 提取、測(cè)序及處理

采用土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒（NucleoSpin 96 Soil Kit，Macherey-Nagel，德國(guó)）進(jìn)行DNA 提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度及濃度。利用特異性引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′對(duì)細(xì)菌 16S rDNA 基因的 V3～V4 變異區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 參考Jia 等［22］的方法，略有改進(jìn)，反應(yīng)體系（50 μL）為：模板 DNA（10 ng）2 μL，10×PCR buffer（MG2+Plus）5 μL，DNTP（10 mmol·L-1）5 μL，Bar-PCR 引物 F（5 μmol·L-1）0.5 μL，引物 R（5 μmol·L-1）0.5 μL，Takapa Tap（5 U·μL-1）0.5 μL，滅菌雙蒸水 36.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共 30個(gè)循環(huán)，72 ℃4 min。將純化質(zhì)量合格、經(jīng)過(guò)定量和均一化的PCR 產(chǎn)物用于DNA 文庫(kù)構(gòu)建，建庫(kù)和測(cè)序，分析委托北京百邁客生物科技有限公司完成。測(cè)序完成后，根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列從得到的下機(jī)數(shù)據(jù)拆分出各樣品數(shù)據(jù)，使用 Flash v. 1.2.7 軟件對(duì)每個(gè)樣品的reads 進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags 數(shù)據(jù)［23］，使用Trimmomatic v. 0.33 軟件過(guò)濾，使用Uchime v. 4.2 軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（effective tags）。使用Qiime v. 1.8.0 軟件中的 Uclust 對(duì)Tags 在97% 的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得分類(lèi)操作單元（operational taxonomic unit，OTU），并基于細(xì)菌（Silva）分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)?4］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行基本數(shù)據(jù)整理、采用One-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析、采用Duncan 法進(jìn)行多重比較、α（Alpha）多樣性指數(shù)與土壤理化因子的皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析，顯著水平為P=0.05。根據(jù)物種注釋情況計(jì)算α 多樣性與β（Bate）多樣性，揭示不同分組處理下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征。α 多樣性指標(biāo)有 Chao1、Ace、香農(nóng)（Shannon）和辛普森（Simpson）指數(shù)，采用 Mothur v.1.30 計(jì)算 α 多樣性指數(shù)［25］。β 多樣性是對(duì)不同樣本的細(xì)菌群落構(gòu)成進(jìn)行比較。利用OTU 之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，首先計(jì)算Unifrac 距離，再利用OTU 的豐度數(shù)據(jù)對(duì)Unifrac 距離構(gòu)建Unweighted unifrac 距離，基于非加權(quán)Unifrac 距離的非度量多維尺度分析（non-matric multidimensional scaling，NMDS）比較不同樣本間的差異。采用R 語(yǔ)言進(jìn)行不同分組處理之間的細(xì)菌群落差異置換多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，Permanova），采用Canaco 5.0 軟件進(jìn)行土壤理化因子與細(xì)菌群落組成之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

不同月份平茬檸條林地土壤含水量、pH、有機(jī)質(zhì)、全氮等10個(gè)理化指標(biāo)具有一定差異（表1）。從土壤含水量來(lái)看，8月平茬顯著高于5月平茬（P＜0.05）。8月平茬的土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀和速效氮的含量均較高，而速效鉀含量顯著低于4月和7月（P＜0.05），速效磷含量顯著低于4月（P＜0.05），pH 也顯著低于其他各月（P＜0.05），但全鹽含量最高。從土壤含水量來(lái)看，9月平茬處理最高，5月最低，達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），其余各月平茬處理之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從土壤有機(jī)質(zhì)含量來(lái)看，8月平茬處理最高，且顯著高于4、5 和6月（P＜0.05）。綜合分析，8月平茬后檸條的恢復(fù)生長(zhǎng)對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響較大。

表1 土壤理化性質(zhì)比較Table 1 Comparison of soil physical and chemical properties

2.2 土壤細(xì)菌群落豐度與α 多樣性

通過(guò)Illumina HiSeq 2500 高通量測(cè)序，所有樣本共獲得1455139 條序列，經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾和去除嵌合體后共產(chǎn)生1288309 條有效優(yōu)質(zhì)序列，經(jīng)過(guò)聚類(lèi)獲得OTU，測(cè)序文庫(kù)的覆蓋度均達(dá)到了99.7%以上，說(shuō)明測(cè)序土壤樣本中絕大部分細(xì)菌序列被測(cè)出，測(cè)序結(jié)果可以表示土壤中細(xì)菌的真實(shí)存在情況。由表2 可知，不同平茬月份的土壤測(cè)序樣本中檢測(cè)到 OTU 數(shù)量以 8月最多，為 1869，9月最少，為 1728，其次較少的是 10月，為 1757，8月分別和 9、10月達(dá)到了顯著差異水平（P＜0.05），其他 4、5、6、7、8月各月平茬處理間土壤細(xì)菌 OTU 數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）。

表2 土壤細(xì)菌α 多樣性Table 2 α diversity of bacteria communities

α 多樣性指數(shù)在不同月份平茬處理之間具有一定差異。8月平茬的土壤細(xì)菌群落的豐富度Chao1 指數(shù)和Ace指數(shù)最高，其次是7月＞4月＞5月＞6月，但相互之間差異不顯著（P＞0.05）；9 和10月平茬的土壤細(xì)菌群落豐富度 Chao1 和 Ace 指數(shù)較低，且與4、5、7、8月之間差異顯著（P＜0.05）。香農(nóng)（Shannon）指數(shù)較高的為 4、6、10月，辛普森（Simpson）指數(shù)均較低，說(shuō)明這3個(gè)月份平茬處理的土壤細(xì)菌群落多樣性較高；9月平茬處理的香農(nóng)（Shannon）指數(shù)顯著低于4、6、8 和10月（P＜0.05），且辛普森（Simpson）指數(shù)最高，顯著高于其他各月（P＜0.05），說(shuō)明9月平茬處理的土壤細(xì)菌群落多樣性最低。

土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)與理化因子Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明，細(xì)菌OTU 與土壤全鉀呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），Ace 和Chao 1 指數(shù)與土壤全鉀呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。細(xì)菌 OTU、Ace、Chao 1、Simpson、Shannon 指數(shù)與其他指標(biāo)間均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系（表3）。

表3 土壤細(xì)菌α 多樣性與土壤性質(zhì)的相關(guān)性Table 3 Correlation between soil bacteria α diversity and soil properties

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

通過(guò)OTU 物種注釋?zhuān)?個(gè)不同月份平茬檸條林地土壤共獲得2028個(gè)OTU。如圖1 所示，不同平茬月份下，相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌所占比例均達(dá)到96%以上。各個(gè)細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度排序也相同，相對(duì)豐度≥1%排序前十的主要細(xì)菌門(mén)類(lèi)及平均豐度值由高到低分別是：變形菌門(mén)（Proteobacteria）26.8%、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）23.44%、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）19.16%、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）11.39%、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）7.08%、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）3.24%、己科河菌門(mén)（Rokubacteria）1.96%、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）1.61%、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）1.13%、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）1.02%，共占細(xì)菌總數(shù)的96.83%，其余門(mén)類(lèi)及未檢出的細(xì)菌門(mén)僅占細(xì)菌總數(shù)的3.17%，其中其他細(xì)菌門(mén)類(lèi)占3.16%，未檢出的僅占0.01%。

圖1 門(mén)水平的細(xì)菌群落相對(duì)豐度（前十）Fig.1 The relative abundance of bacterial communities at the phylum level（top ten）

對(duì)相對(duì)豐度排序前十的細(xì)菌門(mén)物種差異顯著性分析可知（表4），除綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在 7個(gè)不同平茬月份分組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）外，其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)在不同平茬月份分組之間具有一定的差異。其中，相對(duì)豐度大于10%的前四大細(xì)菌門(mén)是變細(xì)菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi），是平茬處理的人工檸條林地中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)。 9月平茬的檸條人工林地土壤第一優(yōu)勢(shì)菌群變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度最高，為 29.74%，且顯著高于10月（P＜0.05），其他各月之間差異不顯著（P＞0.05），7個(gè)處理變形菌門(mén)（Proteobacteria）相對(duì)豐度由高到低排序?yàn)椋篩9＞Y8＞Y4＞Y5＞Y7＞Y6＞Y10。放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）相對(duì)豐度以 5月平茬最高，且顯著高于 4、6、7、8、9月（P＜0.05）。6、7月平茬土壤中的酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）顯著高于 4、5、8、9月（P＜0.05），9月份平茬檸條林地土壤中的酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）豐度最低。芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）8月平茬的土壤中相對(duì)豐度顯著高于其他各月（P＜0.05），其次是9月，10月最低。己科河菌門(mén)（Rokubacteria）和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）相對(duì)豐度分別是6 和10月最高，9月最低，均達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05）。

表4 門(mén)水平下的細(xì)菌群落組成差異（相對(duì)豐度排序前十）Table 4 Difference of bacterial community composition（top ten）of relative abundance at phylum level

2.4 細(xì)菌β 多樣性分析

基于非加權(quán)Unifrac 距離的非度量多維尺度分析表明，不同平茬月份下檸條林地土壤細(xì)菌群落組成存在差異。不同平茬月份組間距離、組內(nèi)距離大小不一致，主要表現(xiàn)為9月與其他各月組間的距離較大，其他各月組間距離小，8、9、10月的組內(nèi)距離大，4、5、6、7月的組內(nèi)距離相對(duì)較小，說(shuō)明 9、10月與其他各月的細(xì)菌群落組成差異較大。不同月份平茬影響了檸條林地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（圖2）。進(jìn)一步結(jié)合置換多元方差分析對(duì)不同分組的樣品之間β 多樣性是否存在顯著差異進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表5 所示，由不同分組兩兩之間的細(xì)菌群落組成差異P值可知，9月分別與 4、5、6、7、8月之間差異極顯著（P＜0.01），10月分別和 4、7月 之 間差異極顯 著（P＜0.01），和5、6、8月之間差異顯著（P＜0.05）。

表5 不同分組之間的細(xì)菌群落差異Permanova 分析P 值Table 5 Bacterial community difference P value between different treats（Permanova）

圖2 細(xì)菌群落組成的非度量多維尺度分析Fig. 2 Non-matric multidimensional scaling analysis（NMDS）of bacterial community composition

2.5 土壤細(xì)菌群落與理化因子的關(guān)系

由于本試驗(yàn)中7個(gè)分組排序前十且相對(duì)豐度大于10%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)只有4個(gè)，而優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬又在10 種以上，所以選擇排序前十的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱與環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析，以便更好地尋找細(xì)菌與環(huán)境因子的相關(guān)性。結(jié)果表明細(xì)菌群落受土壤理化因子影響的程度不同，篩選出影響細(xì)菌群落的6個(gè)主要環(huán)境因子（土壤有機(jī)質(zhì)、全磷、全鉀、速效氮、pH 和含水量）對(duì)群落物種分布的影響具有顯著性（P=0.004），6個(gè)主要土壤環(huán)境因子對(duì)物種分布的累計(jì)解釋率為96.59%，其中RDA 前兩個(gè)排序軸的特征值分別解釋了62.21%和19.69%的細(xì)菌群落變化（圖3）。土壤全磷、速效氮、有機(jī)質(zhì)與第一排序軸正相關(guān)，pH、含水量、全鉀與第一排序軸負(fù)相關(guān)。土壤全磷、速效氮、有機(jī)質(zhì)是貢獻(xiàn)率較大的環(huán)境因子，貢獻(xiàn)率分布為35.4%、21.0%、17.1%，說(shuō)明各處理土壤細(xì)菌群落主要受到該3個(gè)土壤因子的影響。土壤理化因子對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的影響主要表現(xiàn)在放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria）、酸微菌綱（Acidimicrobiia）與土壤pH 呈顯著正相關(guān)，與全磷、速效氮、有機(jī)質(zhì)含量、含水量呈顯著負(fù)相關(guān)；變形菌綱中α 變形菌綱（Alphaproteobacteria）與土壤有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)，與含水量、全鉀呈顯著負(fù)相關(guān)；δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）與含水量、全鉀呈顯著正相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)；γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）與有機(jī)質(zhì)、速效氮、全磷呈顯著正相關(guān)，與pH、全鉀呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖3 細(xì)菌群落（排序前十細(xì)菌綱）和土壤理化因子的冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis for bacterial community（top ten bacteria at class level） and soil physical and chemical factors

3 討論

土壤微生物多樣性是反映微生物群落穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，也能夠反映土壤環(huán)境改變對(duì)微生物群落特征的影響［26］。因此，土壤微生物群落組成及其多樣性對(duì)人為干擾條件下土壤生態(tài)功能的恢復(fù)以及穩(wěn)定性的維持具有重要意義，通常作為指示土壤健康最靈敏的指標(biāo)［27］。平茬是干旱地區(qū)提高人工檸條林生產(chǎn)力的重要方式之一，目的是通過(guò)控制灌木生長(zhǎng)，減少干旱地區(qū)人工植被對(duì)水分的過(guò)度利用，促進(jìn)檸條根系和灌木林下草本植物的生長(zhǎng)，提高生物多樣性［28-29］。植被的地上地下部分生長(zhǎng)均會(huì)對(duì)土壤性質(zhì)、酶活性、微生物等產(chǎn)生影響［30-31］，從而改善林地土壤生態(tài)環(huán)境。鄭佳華等［17］對(duì)內(nèi)蒙古錫林浩特典型大針茅（Stipa grandis）草原刈割研究表明，刈割改變了大針茅草原土壤細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。Chen 等［16］研究發(fā)現(xiàn)在溫帶草原刈割后氨氧化菌的豐度發(fā)生了顯著變化，分析原因認(rèn)為刈割可能是導(dǎo)致參與氮循環(huán)的微生物群落組成發(fā)生變化的主要因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明：檸條生長(zhǎng)季節(jié)的4-10月不同月份平茬后檸條人工林地土壤細(xì)菌群落組成類(lèi)群沒(méi)有差異，但對(duì)變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群相對(duì)豐度產(chǎn)生了影響，生長(zhǎng)旺盛季節(jié)的4、6月平茬的檸條林地土壤細(xì)菌Alpha 多樣性指數(shù)較高，而生長(zhǎng)季末的9 和10月偏低，土壤細(xì)菌物種相對(duì)較少，說(shuō)明從時(shí)間上分析，春夏季平茬由于檸條恢復(fù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，檸條灌叢的生長(zhǎng)發(fā)育引起土壤資源空間異質(zhì)性，土壤養(yǎng)分聚集［7，27］，有利于形成更佳的微生物生長(zhǎng)環(huán)境，從而有利于土壤微生物活動(dòng)［32］。前人研究表明，平茬后恢復(fù)生長(zhǎng)的檸條林地植物多樣性更高，這也會(huì)增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，并調(diào)節(jié)土壤含水量［33-34］，使得土壤微生物的生存環(huán)境得到改善。9月后寧夏荒漠草原區(qū)的氣溫較低、檸條平茬生長(zhǎng)期較短、恢復(fù)生長(zhǎng)能力相對(duì)低于其他時(shí)間，對(duì)土壤性質(zhì)和微生物勢(shì)必產(chǎn)生影響。植物與土壤環(huán)境相互作用，平茬移除了植株地上殘枝或部分植株，減少了土壤中C 和N 的輸入，對(duì)C 和N 源敏感的細(xì)菌類(lèi)群，如變形菌、放線(xiàn)菌就會(huì)產(chǎn)生影響［17］。為了更好地利用檸條資源，生長(zhǎng)季平茬優(yōu)于冬季平茬已得到廣泛認(rèn)可［35］，但合理的平茬時(shí)間應(yīng)依據(jù)區(qū)域氣候條件、立地土壤狀況、檸條長(zhǎng)勢(shì)和生產(chǎn)用途等具體情況而定。

不同月份平茬的檸條人工林地土壤細(xì)菌第一優(yōu)勢(shì)類(lèi)群都是變形菌門(mén)，已有研究普遍認(rèn)為變形菌門(mén)是世界上最普遍的菌門(mén)，與碳源的利用緊密相關(guān)［36］。4-9月平茬的檸條林地變形菌門(mén)相對(duì)豐度均顯著高于10月平茬，而與碳源有關(guān)的土壤有機(jī)質(zhì)含量卻是6月最小，說(shuō)明平茬各月土壤碳源對(duì)變形菌門(mén)產(chǎn)生了不同影響。土壤氮素與α變形菌綱、芽單胞菌綱存在正相關(guān)關(guān)系，這也驗(yàn)證了孫懷博［37］的研究結(jié)果，而Cruz-Martinez 等［38］研究則認(rèn)為放線(xiàn)菌門(mén)與土壤碳、氮含量沒(méi)有直接相關(guān)性。牛宋芳［10］對(duì)寧夏荒漠草原不同土壤類(lèi)型人工檸條林根際細(xì)菌群落的研究也發(fā)現(xiàn)，土壤碳、氮同變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系。放線(xiàn)菌門(mén)是僅次于變形菌門(mén)的第二優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，這可能與荒漠草原檸條林地環(huán)境惡劣、氣候干旱等氣候條件適合于放線(xiàn)菌的生存與繁殖有關(guān)。放線(xiàn)菌能產(chǎn)生抗生素、促進(jìn)動(dòng)植物殘?bào)w在土壤中快速分解、參與土壤碳、氮、磷等養(yǎng)分循環(huán)［17］，也反映出試驗(yàn)區(qū)荒漠草原檸條林地土壤中富含廣泛的抗生素產(chǎn)生菌資源，可以進(jìn)一步挖掘利用。酸桿菌門(mén)主要生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中［39］，其豐度與氮的可用性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［40］，這可能與氮導(dǎo)致土壤pH 下降有關(guān)［41］。本研究中酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度排序第三，說(shuō)明荒漠草原檸條人工林地的土壤養(yǎng)分貧乏，需要通過(guò)平茬措施加快檸條林的恢復(fù)生長(zhǎng)，從而改善土壤結(jié)構(gòu)和養(yǎng)分狀況，6 和7月平茬的酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度較高，也說(shuō)明了這兩個(gè)月平茬對(duì)土壤酸桿菌門(mén)有利。

在荒漠地區(qū)構(gòu)建錦雞兒（Caragana）人工林能夠顯著提高土壤養(yǎng)分，相對(duì)于未平茬處理，對(duì)錦雞兒人工林進(jìn)行平茬可提高其鄰居草本群落的養(yǎng)分，降低土壤pH，提高地上植被群落的物種多樣性等［7］，而土壤養(yǎng)分含量的變化導(dǎo)致了土壤細(xì)菌的組成及群落結(jié)構(gòu)的變化［42］。土壤可利用性氮、有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分狀況對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有著重要影響［43］。羅旦等［44］研究認(rèn)為全氮、速效氮、全磷和速效鉀是影響陜北沙區(qū)檸條、沙柳（Salix cheilophila）、沙蒿（Artemisia desertorum）等3 種植物根際土壤細(xì)菌豐富度的主要因素。8月平茬的檸條林地全氮和速效氮的含量均顯著高于其他各月平茬處理，說(shuō)明8月平茬有利于檸條根部積累更多的根瘤菌固定空氣中的游離態(tài)氮，增加土壤含氮量。平茬的人為干擾使得土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變［17］。在土壤碳、氮庫(kù)十分貧乏，氣候條件較為惡劣的干旱、半干旱荒漠草原地區(qū)，特定區(qū)域的微生物群落組成受到特定環(huán)境因素的直接或間接調(diào)控與影響。本試驗(yàn)僅研究了細(xì)菌，也沒(méi)有考慮未平茬的影響，對(duì)于平茬后植被恢復(fù)生長(zhǎng)程度的差異對(duì)土壤特殊功能類(lèi)群菌種響應(yīng)機(jī)制的研究還有待于進(jìn)一步深入。

4 結(jié)論

平茬對(duì)檸條林地土壤細(xì)菌群落分布產(chǎn)生了影響，不同月份平茬間土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群組成存在一定差異。排在前五的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度大小排序均為：變形菌門(mén)（Proteobacteria）＞放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）＞酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）＞綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）＞芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）。9月平茬的檸條林地土壤變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度最高，5月平茬的放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）的豐度最高，7月平茬的酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）的豐度較高，8月平茬的芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）豐度最高。不同月份平茬對(duì)檸條林地土壤細(xì)菌多樣性具有一定影響。8月平茬的土壤細(xì)菌群落的豐富度Chao1 和Ace 指數(shù)較高，9月平茬的土壤細(xì)菌群落多樣性最低。不同月份平茬細(xì)菌群落受土壤環(huán)境因子的影響不一致。土壤全磷、速效氮、有機(jī)質(zhì)是主要影響因素。生長(zhǎng)季節(jié)的4-8月平茬優(yōu)于9 和10月。