雙氫青蒿素對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用及其對(duì)濾泡輔助性T細(xì)胞的調(diào)控作用

薛美娟，黃俊霞，楊 驥

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海 200032

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是多種因素共同作用而導(dǎo)致免疫功能異常的自身免疫性疾病，可累及全身多種組織和器官。SLE的主要特征是產(chǎn)生大量自身抗體，形成免疫復(fù)合物在組織中沉積，導(dǎo)致補(bǔ)體激活，自身反應(yīng)性細(xì)胞增多［1-2］。濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cells，TFH）作為一類特殊的CD4＋T細(xì)胞亞群，其主要作用是輔助B細(xì)胞分化增殖、抗體分泌，B細(xì)胞產(chǎn)生大量自身免疫性抗體，造成SLE免疫炎癥損傷［3-4］。TFH細(xì)胞及分泌的IL-21增多與SLE病情活動(dòng)度、自身抗體分泌正相關(guān)［5-6］。

青蒿素及其衍生物除抗瘧作用外，雙氫青蒿素高效且低毒，有較明顯的免疫抑制作用，有良好開(kāi)發(fā)前景，但有關(guān)雙氫青蒿素治療SLE的免疫研究機(jī)制仍較少［7-10］。有研究［11］表明，雙氫青蒿素在SLE中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，抑制Th17細(xì)胞分化及促炎作用，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化及其免疫抑制作用。迄今未發(fā)現(xiàn)關(guān)于雙氫青蒿素對(duì)狼瘡鼠體內(nèi)外TFH細(xì)胞的調(diào)控研究。本研究旨在探討雙氫青蒿素對(duì)狼瘡鼠的治療作用，及其在體內(nèi)外對(duì)TFH細(xì)胞分化的調(diào)控作用，為雙氫青蒿素應(yīng)用于紅斑狼瘡治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料雌性MRL/lpr狼瘡鼠購(gòu)買(mǎi)自中科院上海生命科學(xué)院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；雙氫青蒿素（相對(duì)分子質(zhì)量284.35）購(gòu)買(mǎi)自CSNpharm公司；IL-21和IL-6于Peprotech公司購(gòu)買(mǎi)；初始CD4＋T細(xì)胞分選試劑盒和T細(xì)胞活化/擴(kuò)增試劑盒購(gòu)買(mǎi)自德國(guó)美天旎公司（Miltenyi Biotec）；尿蛋白檢測(cè)試劑盒來(lái)自南京建成生物工程研究所；異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4流式抗體、別藻藍(lán)蛋白（APC）-CXCR5流式抗體、藻紅蛋白（PE）-PD-1流式抗體均來(lái)自于BD公司。IL-21酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)買(mǎi)自R&D Systems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理12只12周齡的雌性MRL/lpr鼠，飼養(yǎng)于我院SPF級(jí)動(dòng)物房，體質(zhì)量（30.1±2.1）g。隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為2組，雙氫青蒿素治療組和對(duì)照組，每組各6只。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［11-13］及咨詢CSNpharm公司實(shí)驗(yàn)人員，100~150 mg/kg雙氫青蒿素灌胃治療可有效治療狼瘡癥狀。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予150 mg/kg雙氫青蒿素灌胃給藥，1次/d，持續(xù)給藥4至16周，對(duì)照組以同樣方法PBS溶液灌胃給藥。治療結(jié)束時(shí)使用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)24 h尿蛋白，之后處死狼瘡鼠，取脾稱重，剪碎研磨脾臟從其中分離單個(gè)核細(xì)胞，之后用FITC-CD4、PE-PD-1、APC-CXCR5流式抗體，4℃避光染色20 min，上機(jī)檢測(cè)圈出CD4＋T淋巴細(xì)胞，再?gòu)腃D4＋T的淋巴細(xì)胞圖中圈出PD-1＋和CXCR5＋的淋巴細(xì)胞，計(jì)算CXCR5＋PD-1＋淋巴細(xì)胞在CD4＋細(xì)胞中的百分比。取腎臟，放入4%多聚甲醛固定，其后經(jīng)脫水透明處理后，樣品浸蠟包埋，病理切片機(jī)切片，根據(jù)H-E染色進(jìn)行腎臟病理評(píng)分，評(píng)分方法參考該文獻(xiàn)［14］。收集血清，ELISA試劑盒檢測(cè)治療組和對(duì)照組抗ds-DNA抗體及ANA抗體含量。

1.3 體外TFH細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)分化及流式檢測(cè)從對(duì)照組MRL/lpr狼瘡鼠中分離單個(gè)核細(xì)胞，初始CD4＋T細(xì)胞試劑盒分選初始CD4＋T細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 ng/mL IL-21、20 ng/mL IL-6和T細(xì)胞活化/擴(kuò)增試劑盒中的MACSiBeads Particles誘導(dǎo)分化5 d，不同濃度梯度（0 μM、0.1 μM、1.0 μM、10 μM）雙氫青蒿素干預(yù)，共分為4組。體外培養(yǎng)5 d后，用FITC-CD4、PE-PD-1、APCCXCR5流式抗體4℃避光染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4＋CXCR5＋PD-1＋T細(xì)胞在CD4＋T細(xì)胞中的比例。

1.4 IL-21水平測(cè)定收集上述TFH細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)IL-21 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TFH細(xì)胞分化過(guò)程中分泌的IL-21含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 7.0軟件，通過(guò)Studentt檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 雙氫青蒿素對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用結(jié)果（圖1、表1）顯示：雙氫青蒿素系統(tǒng)治療MRL/lpr小鼠4周后與對(duì)照組相比較，24 h尿蛋白含量更低，分別為（1 536±150.1）μg/24 h和（2 548±93.30）μg/24 h，t＝5.726，P＜0.01。雙氫青蒿素治療組腎臟病理評(píng)分是2.410±0.535，對(duì)照組為5.713±0.662，t＝6.716，P＜0.01。治療組抗ds-DNA抗體低于對(duì)照組［（345.3±29.00）vs（477.8±20.07）IU/mL，t＝7.514，P＜0.01］，治療組ANA抗體也低于對(duì)照組［（514.5±19.64）vs（726.3±16.27）IU/mL，t＝8.302，P＜0.01］。

圖1 雙氫青蒿素治療MRL/lpr狼瘡鼠腎炎H-E染色圖

表1 雙氫青蒿素治療組對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用

2.2 雙氫青蒿素抑制MRL/lpr狼瘡鼠體內(nèi)外的TFH細(xì)胞分化雙氫青蒿素治療MRL/lpr狼瘡鼠4周后，可有效抑制MRL/lpr狼瘡鼠脾臟增生，治療組脾臟重量（0.28±0.03）g，對(duì)照組（0.69±0.04）g（t＝13.83，P＜0.01）。 雙 氫 青蒿素治療組和對(duì)照組脾臟中TFH細(xì)胞比例分別為（12.40%±2.726%） 和（36.33%±2.750%），t＝10.71，P＜0.01，見(jiàn)圖2。體外培養(yǎng)TFH細(xì)胞，0 μM與 0.1 μM、1.0 μM、10 μM雙氫青蒿素干預(yù)，CD4＋CXCR5＋PD-1＋TFH細(xì)胞比例和分泌的IL-21水平隨著雙氫青蒿素濃度增加而降低，相鄰2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖2 流式檢測(cè)MRL/lpr狼瘡鼠脾臟中CD4＋ CXCR5＋ PD-1＋ TFH細(xì)胞百分比

圖3 雙氫青蒿素體外抑制MRL/lpr狼瘡鼠TFH細(xì)胞分化及其IL-21的分泌

3 討 論

SLE是一種常見(jiàn)的累及多系統(tǒng)多器官的自身免疫性疾病，目前主要的治療藥物為糖皮質(zhì)激素，某些特定類型的SLE亦可使用環(huán)磷酰胺和生物制劑等免疫抑制劑，但長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制藥物會(huì)引起諸多嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，進(jìn)一步研究SLE免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，尋找新的高效低毒治療藥物，對(duì)提高SLE診療水平具有重要意義。

SLE是一種以B細(xì)胞過(guò)度活化和致病性自身抗體形成增加為特征、累及全身系統(tǒng)器官的自身免疫性疾病。TFH細(xì)胞主要輔助B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化、促進(jìn)抗體分泌。諸多前期研究［5,15］發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中TFH細(xì)胞比例增多，與自身抗體滴度正相關(guān)，并與SLE病情活動(dòng)密切相關(guān)。在MRL/lpr狼瘡鼠中也證實(shí)TFH細(xì)胞和其分泌的IL-21與生發(fā)中心擴(kuò)增和自身抗體分泌密切相關(guān)［6］。SLE發(fā)病與TFH細(xì)胞過(guò)度活化和IL-21過(guò)量分泌密切相關(guān)，因此抑制TFH細(xì)胞分化和功能可能進(jìn)一步抑制B細(xì)胞過(guò)度活化和抗體分泌，從而TFH細(xì)胞可作為治療SLE的有效靶點(diǎn)［16］。

自屠呦呦教授團(tuán)隊(duì)因研發(fā)青蒿素獲諾貝爾獎(jiǎng)后，青蒿素及其衍生物的研究備受關(guān)注。青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生大量水溶性和脂溶性衍生物，如雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等。雙氫青蒿素除有抗瘧疾作用外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用［7,17-18］。例如，有研究［9］顯示，雙氫青蒿素衍生物DC32通過(guò)恢復(fù)Treg/Th17平衡和下調(diào)IL-6來(lái)減輕小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。雙氫青蒿素通過(guò)抑制MRL/lpr鼠中Toll樣受體4信號(hào)通路的激活和脾細(xì)胞中Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生進(jìn)而緩解狼瘡炎癥損傷［13］。本研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素可有效緩解狼瘡鼠腎臟損傷，降低24 h尿蛋白、抗ds-DNA抗體和ANA抗體滴度，可有效抑制狼瘡鼠脾臟增生、抑制TFH細(xì)胞增生。體外研究表明，雙氫青蒿素可劑量依賴性抑制TFH細(xì)胞分化及IL-21的分泌，提示雙氫青蒿素可能通過(guò)抑制TFH細(xì)胞擴(kuò)增分化及其細(xì)胞因子分泌，從而達(dá)到治療狼瘡的作用。

綜上所述，本研究?jī)H從雙氫青蒿素對(duì)TFH細(xì)胞的影響揭示了部分治療機(jī)制，而緩解狼瘡發(fā)病的其他機(jī)制還有待更多研究。雙氫青蒿素具有較為明確的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，隨著相關(guān)研究的增多，有望應(yīng)用于SLE等自身免疫性疾病的治療。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。