基于全腫瘤MRI篩選胰腺導(dǎo)管腺癌SMAD4表達(dá)影像-生物學(xué)標(biāo)志物

梁 亮 ，董 行 ，羅榮奎，丁 鶯 ，周建軍 ，曾蒙蘇 *

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院放射科，廈門 361015

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科，上海 200032

3.上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海 200032

4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

作為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，胰腺癌2018年全球新發(fā)病例達(dá)458 918例［1］，胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是其最常見的病理類型，惡性程度較高。由于缺乏有效的治療手段，患者預(yù)后大多較差，5年總生存率僅約7%［2］。目前，胰腺癌治療前的影像學(xué)評估主要基于病變形態(tài)、周圍結(jié)構(gòu)侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，無法充分反映胰腺癌的生物學(xué)特性，因此對治療方案的選擇、療效和患者生存質(zhì)量造成影響［3］。

研究生物學(xué)標(biāo)志物是了解胰腺癌生物學(xué)行為的有效手段［4］。SMAD4基因是PDAC最重要的抑癌基因之一，其缺失導(dǎo)致腫瘤更具侵襲性，與腫瘤的發(fā)展及療效、預(yù)后不佳密切相關(guān)［5-7］。不同SMAD4基因表達(dá)患者的復(fù)發(fā)模式不同，SMAD4缺失者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而表達(dá)SMAD4者多為局部侵犯［8-9］。因此，明確PDAC患者SMAD4基因表達(dá)對胰腺癌個(gè)體化精準(zhǔn)診治具有重要的臨床價(jià)值。

臨床發(fā)現(xiàn)病變時(shí)，僅10%～30%的胰腺癌符合可手術(shù)切除條件［10-12］。而非手術(shù)活檢常難以獲得滿意的胰腺癌組織標(biāo)本，且無法完整反映腫瘤的生物學(xué)特性和異質(zhì)性。近年來興起的影像組學(xué)技術(shù)能挖掘常規(guī)醫(yī)學(xué)影像中蘊(yùn)含的深層數(shù)據(jù)，從中提取并定量分析高通量數(shù)據(jù)，在腫瘤生物學(xué)行為評估方面更有優(yōu)勢［13］，且可以發(fā)現(xiàn)肉眼無法識別的腫瘤特征［14］。以往研究［15-17］基于CT圖像和紋理分析，發(fā)現(xiàn)影像組學(xué)特征與胰腺癌患者生存情況及組織病理學(xué)等有一定相關(guān)性。但基于MRI的胰腺癌全腫瘤影像組學(xué)研究目前較少，且未見胰腺導(dǎo)管腺癌SMAD4基因表達(dá)相關(guān)影像-生物學(xué)標(biāo)志物研究報(bào)道。

本研究應(yīng)用MRI和影像組學(xué)分析方法對PDAC進(jìn)行全腫瘤影像學(xué)評價(jià)，結(jié)合組織病理學(xué)和SMAD4表達(dá)情況，尋找PDAC SMAD4表達(dá)的影像-生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年1月至2017年9月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受Magnetom Aera 1.5T MRI行腹部增強(qiáng)檢查且疑似胰腺惡性腫瘤的患者326例，其中經(jīng)本院手術(shù)病理學(xué)證實(shí)為PDAC，且符合入選排除標(biāo)準(zhǔn)的患者60例。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（B2018-266），并免除書面知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在本院接受同一臺1.5T MRI腹部增強(qiáng)檢查，圖像質(zhì)量不影響全腫瘤評價(jià)；（2）手術(shù)后病理檢查證實(shí)為PDAC；（3）MRI檢查后1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行術(shù)前實(shí)驗(yàn)室檢查及手術(shù)；（4）患者臨床資料完整，包括基本信息、實(shí)驗(yàn)室檢查、手術(shù)經(jīng)過、病理檢查等；（5）有SMAD4表達(dá)檢測結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：MRI檢查前行經(jīng)皮肝穿刺膽道引流（PTCD）、放置膽管支架或抗腫瘤治療，以及其他不宜參加研究的因素。

1.2 MRI檢查采用Magnetom Aera 1.5T MRI 成像儀（Siemens Healthcare公司）及相陣控體線圈，序列參數(shù)見表1。動態(tài)增強(qiáng)掃描采用自動監(jiān)測觸發(fā)掃描，監(jiān)測層面為腹主動脈。信號值達(dá)90時(shí)觸發(fā)并延遲10 s開始動脈期掃描，30 s后行門脈期掃描，80～120 s后行延遲期掃描。對比劑：釓噴酸葡胺，以0.1 mmol/kg注射，注射速率為1～2 mL/s。

表1 磁共振成像參數(shù)

1.3 全腫瘤影像組學(xué)特征提取

1.3.1 病灶分割由1名放射診斷醫(yī)師（具有11年腹部影像診斷經(jīng)驗(yàn)）利用影像組學(xué)分析軟件（Radiomics, Siemens Healthcare公司），基于工作流中3D域的通用自動分割算法進(jìn)行半自動腫瘤分割，覆蓋腫瘤整體，分割序列包括T1WI (VIBE)、T2WI、ADC圖、動脈期、門脈期和延遲期，當(dāng)分割輪廓不正確時(shí)由研究者手動編輯輪廓。所有分割圖像均由另一名放射診斷醫(yī)師（具有13年腹部影像診斷經(jīng)驗(yàn)）檢查確認(rèn)。

基于工作流中3D域的通用自動分割算法進(jìn)行半自動分割，分析軟件自動識別全腫瘤輪廓（黃線勾畫），見圖1。研究者于橫斷位（左上圖）、矢狀位（右上圖）和冠狀位（左下圖）連續(xù)層面確認(rèn)輪廓是否準(zhǔn)確，當(dāng)分割輪廓不正確時(shí)由研究者手動編輯輪廓，勾畫完成后提取整體全腫瘤（右下圖黃色標(biāo)識）進(jìn)行分析。

圖1 Radiomics病灶分割

1.3.2 特征提取病灶分割完成后，軟件基于Pyradiomics library算法［18］自動提取病灶全腫瘤影像組學(xué)特征。每個(gè)序列獲得影像組學(xué)特征1 214個(gè)，其中包括一階統(tǒng)計(jì)（19個(gè)）、基于形狀（16個(gè)）、GLCM（24個(gè)）、GLRLM（16個(gè)）、GLSZM（16個(gè)）、NGTDM（5個(gè)）、GLDM（14個(gè)）七大類共110個(gè)，每個(gè)特征同時(shí)經(jīng)平方、平方根、對數(shù)、指數(shù)和小波等多個(gè)濾波器計(jì)算變換額外特征。

1.4 圖像分析

1.4.1 主觀評價(jià)由上述2名放射診斷醫(yī)師共同對PDAC影像學(xué)征象進(jìn)行評價(jià)，由爭議時(shí)經(jīng)討論取得一致。評價(jià)利用PACS系統(tǒng)完成，指標(biāo)包括病灶MRI信號、形態(tài)、境界、強(qiáng)化方式、有無壞死囊變、是否浸潤胰周組織、是否侵犯周圍血管、遠(yuǎn)端胰管是否擴(kuò)張、遠(yuǎn)端胰腺是否萎縮、是否伴隨潴留囊腫形成等。

1.4.2 全腫瘤影像學(xué)定量評價(jià)對病灶短徑、長徑、全腫瘤ADC值、動脈期強(qiáng)化率、門脈期強(qiáng)化率、延遲期強(qiáng)化率、門脈期與動脈期強(qiáng)化差異、延遲期與動脈期強(qiáng)化差異及延遲期與門脈期強(qiáng)化差異等進(jìn)行定量評價(jià)。原始定量數(shù)據(jù)利用影像組學(xué)一階統(tǒng)計(jì)指標(biāo)獲得。平掃T1WI (VIBE)、T2WI、動脈期、門脈期及延遲期5個(gè)序列共6 070個(gè)征象進(jìn)入影像基因組學(xué)特征篩選。

1.5 病理學(xué)評價(jià)SMAD4表達(dá)采用EnVision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測。組織蠟塊以4 μm厚度切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化及抗原修復(fù)后，使用抗SMAD4抗體（小鼠單克隆抗體B-8，sc-7966；Santa Cruz公司；1∶300稀釋），應(yīng)用全自動免疫組化染色系統(tǒng)（Bond Max，Leica Biosystems Melbourne Pty）及其配套聚合物優(yōu)化檢測試劑系統(tǒng)（DS9800，含過氧化物酶封閉劑、一抗后試劑、二抗試劑、DAB顯色液及蘇木精復(fù)染液，Leica Biosystems Newcastle）對切片進(jìn)行染色。由我院一名病理科醫(yī)師（具有8年病理診斷經(jīng)驗(yàn)）對患者病理組織切片重新閱片評價(jià)，確認(rèn)病理類型及分化情況，并分析SMAD4表達(dá)情況［19］。SMAD4染色陽性區(qū)域小于10%者判定為SMAD4陰性表達(dá)（基因缺失）。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果將患者分為SMAD4陽性表達(dá)組（圖2A）和陰性表達(dá)組（圖2B）。

圖2 PDAC組織SMAD4表達(dá)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類變量以n(%)表示，組間比較采用Fisher確切概率法；連續(xù)性變量以x±s或M（P25,P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

通過最大相關(guān)最小冗余（maximum relevance minimum redundancy，mRMR）算法評估影像基因組學(xué)特征的冗余度和相關(guān)性，評估依據(jù)為互信息（mutual information，MI），校正P值閾值設(shè)定為0.10。多因素融合最佳模型通過最佳子集正向選擇獲得：從最佳特征開始，迭代所有剩余特征，將該特征添加到模型中，從而優(yōu)化所選標(biāo)準(zhǔn)；重復(fù)此過程，直到達(dá)到預(yù)定義的最大特征數(shù)。最佳子集依據(jù)貝葉斯信息準(zhǔn)則（Bayesian information criterion，BIC）選擇，BIC值最小者為最佳子集。確定最佳子集后，采用ROC曲線檢測其診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料及病理學(xué)評價(jià)60例PDAC患者中，SMAD4陽性表達(dá)者11例（18.3%），SMAD4陰性表達(dá)者49例（81.7%）。結(jié)果（表2）顯示：2組性別分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.012），SMAD4陽性組以女性居多；2組年齡、CEA、CA19-9、病灶位置及分化程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 臨床資料及病理學(xué)評價(jià)

2.2 影像學(xué)主觀評價(jià)結(jié)果（表3、圖3）顯示：2組間T1WI、T2WI信號，增強(qiáng)后延遲強(qiáng)化，病變侵犯等情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 不同SMAD4表達(dá)組PDAC影像學(xué)表現(xiàn)

表3 2組間影像學(xué)主觀評價(jià)比較

2.3 全腫瘤影像學(xué)定量評價(jià)結(jié)果（表4）顯示：2組病灶大小、ADC、不同時(shí)相強(qiáng)化率及強(qiáng)化差異 的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 2組間全腫瘤影像學(xué)定量評價(jià)比較

2.4 全腫瘤影像組學(xué)分析經(jīng)基于SMAD4表達(dá)的PDAC全腫瘤影像組學(xué)特征篩選，共獲得6個(gè)影像組學(xué)特征（表5、圖4），用于多因素影像基因組學(xué)特征融合建模。建模所得最佳特征子集為門脈期_wavelet-HHL_NGTDM_Contrast+T1WI_wavelet-HHL_GLDM_HighGrayLevelEmphasis（表6），BIC為33.4；ROC分析（圖5）顯示：該子集預(yù)測PDAC患者SMAD4表達(dá)的曲線下面積（AUC）為0.92（P＜0.001），預(yù)測靈敏度為90.9%、特異度為81.6%，組內(nèi)預(yù)測準(zhǔn)確度為83.3%。

表5 基于SMAD4表達(dá)的PDAC全腫瘤影像組學(xué)特征單因素篩選結(jié)果

圖4 基于SMAD4表達(dá)的PDAC全腫瘤影像組學(xué)特征單因素篩選熱圖

表6 SMAD4表達(dá)的PDAC全腫瘤影像基因組學(xué)特征最佳子集

圖5 全腫瘤影像基因組學(xué)特征最佳子集預(yù)測SMAD4表達(dá)的ROC曲線

用顏色表示篩選所得6個(gè)特征的分布情況，綠色代表低值、黃色代表高值、黃綠色代表中間值；每行表示1個(gè)影像組學(xué)特征，列對應(yīng)所有研究對象，上方淺藍(lán)色對應(yīng)SMAD4陽性表達(dá)者11例，上方深藍(lán)色對應(yīng)SMAD4陰性表達(dá)者49例。

3 討 論

全球胰腺癌發(fā)病率占癌癥的第11位，2018年所導(dǎo)致的死亡占癌癥的第7位［1］。由于其缺乏有效治療手段，患者預(yù)后多較差，且致死率不斷上升。有研究［20］認(rèn)為，2030年，胰腺癌將成為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。對胰腺癌生物學(xué)行為的深入了解，將胰腺癌的影像學(xué)評估由單純的形態(tài)學(xué)評價(jià)向影像-生物學(xué)評價(jià)模式轉(zhuǎn)變，作為組織病理學(xué)標(biāo)志物的補(bǔ)充，有利于胰腺癌診治手段的發(fā)展。

SMAD4基因是重要的PDAC生物學(xué)標(biāo)志物，是其最重要的抑癌基因之一。在PDAC患者中，SMAD4的缺失比例為55%～81.6%［7,19］，本研究中SMAD4基因缺失比例與此相符。SMAD4基因與細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)，功能包括抑制腫瘤生長、介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等［21-22］，缺失將導(dǎo)致腫瘤更具侵襲性。

本研究中，SMAD4陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組間性別分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SMAD4陰性表達(dá)組中男性比例高于SMAD4陽性表達(dá)組（P＝0.012），這可能是男性PDAC患者死亡率高于女性的原因之一。

本研究中，2組影像學(xué)主觀評價(jià)及定量評價(jià)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以往研究［23］對PDAC的CT表現(xiàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)SMAD4的PDAC境界更清楚、胰周組織浸潤較SMAD4表達(dá)陰性者少，但組間差異不大。本研究的主觀評價(jià)指標(biāo)中，SMAD4陽性表達(dá)組的形態(tài)不規(guī)則（27.3%vs38.8%）、壞死囊變（0vs14.3%）和侵犯周圍血管（27.3%vs49.0%）比例均低于陰性表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

本研究中，影像組學(xué)技術(shù)一定程度上彌補(bǔ)了上述影像學(xué)常規(guī)評價(jià)未能發(fā)現(xiàn)SMAD4基因相關(guān)影像-生物學(xué)標(biāo)志物的不足，并初步建立了PDAC影像基因組學(xué)模型。作為發(fā)展于影像組學(xué)的技術(shù)，影像基因組學(xué)將影像與基因相關(guān)特征相互關(guān)聯(lián)［24］，從而深入了解腫瘤生物學(xué)行為、發(fā)掘腫瘤內(nèi)在的異質(zhì)性，是個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向之一［25］。影像基因組學(xué)的研究與應(yīng)用，有望實(shí)現(xiàn)在體全腫瘤基因分析，預(yù)測個(gè)體治療的療效、可能的不良反應(yīng)，從而選擇最優(yōu)治療方案、改善預(yù)后［26］。

此外，本研究對PDAC病灶進(jìn)行了全腫瘤影像學(xué)評價(jià)。與僅選取最大橫截面進(jìn)行分析相比，全腫瘤影像學(xué)分析更能體現(xiàn)腫瘤的內(nèi)在生物學(xué)特征，并避免研究過程中選取最大橫截面時(shí)發(fā)生的選擇偏倚，結(jié)果更可靠［27］。因此，包括影像組學(xué)特征在內(nèi)的全腫瘤影像學(xué)分析有望無創(chuàng)獲取PDAC的影像-生物學(xué)標(biāo)志物，且無需增加額外的檢查和醫(yī)療費(fèi)用。

本研究僅探討了PDAC單一基因相關(guān)的影像基因組學(xué)特征，但篩選所得的最佳特征子集具有較好的診斷效能（AUC為0.92，組內(nèi)預(yù)測準(zhǔn)確度為83.3%），子集內(nèi)的特征代表了病灶體素灰度的分布、變化和差異等圖像深層信息，反映了腫瘤的異質(zhì)性等生物學(xué)特征［13］。目前，PDAC相關(guān)影像-生物學(xué)標(biāo)志物及影像基因組學(xué)研究仍然較少，本研究可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

本研究也存在一定的局限性：（1）由于病例數(shù)相對較少，未對影像基因組學(xué)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，而在特征篩選過程中通過mRMR算法和校正P值確保了組內(nèi)特征篩選的可靠性；（2）僅對SMAD4基因表達(dá)進(jìn)行了研究，今后希望能在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上，通過多種檢測方法實(shí)施PDAC多基因融合的影像基因組學(xué)研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。