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    新生小鼠與成年小鼠心肌環(huán)狀RNA差異表達(dá)分析

    2022-07-08 11:07:18賈笑冬于海波宋海旭桑占發(fā)閆承慧
    臨床軍醫(yī)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:乳鼠心肌細(xì)胞調(diào)控

    賈笑冬, 于海波, 宋海旭, 桑占發(fā), 梅 竹, 劉 晶, 閆承慧

    1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016;2.解放軍三二二九五部隊(duì) 檢驗(yàn)病理科,遼寧 遼陽 111000

    成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞失去再生能力是心臟組織發(fā)生損傷無法自我修復(fù)的根本原因,也是心肌梗死等疾病導(dǎo)致心臟衰竭甚至死亡的關(guān)鍵原因[1]。盡管有研究發(fā)現(xiàn)成年心肌存在再生潛能[2],但在大多情況下,成熟心肌的再生能力十分有限,或處于關(guān)閉狀態(tài),難以滿足病理情況下心肌增殖修復(fù)的需要[3]。闡明成熟心肌增殖再生功能的調(diào)控機(jī)制,有效誘導(dǎo)損傷的心臟組織通過內(nèi)源性心肌細(xì)胞增殖進(jìn)行修復(fù),是心血管疾病研究面臨的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。有研究證實(shí),新生24 h內(nèi)的小鼠心肌細(xì)胞仍具有良好的增殖能力[4]。然而,出生7 d后,隨著心肌細(xì)胞成熟,新生小鼠(乳鼠)心肌細(xì)胞的增殖能力就會(huì)喪失。從遺傳學(xué)角度分析,成年小鼠(成鼠)與乳鼠具有完全相同的基因組信息,因此,影響心肌細(xì)胞再生功能的調(diào)控開關(guān)應(yīng)該主要在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中[5]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)通過與關(guān)聯(lián)的微小RNA(microRNA,miRNA)相互作用,circRNA在病理生理過程中發(fā)揮重要作用[6-9]。目前,關(guān)于心肌細(xì)胞增殖能力調(diào)控相關(guān)的circRNA報(bào)道較少?;诖?,本研究應(yīng)用乳鼠和成鼠的心臟組織進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組芯片的大數(shù)據(jù)分析,旨在尋找差異表達(dá)的circRNA及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 收集新生24 h內(nèi)的雄性C57BL/6J乳 鼠和8周齡C57BL/6J雄性 成 鼠 各3只。C57BL/6J小鼠購自集萃藥康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.2 心臟組織標(biāo)本收集 將小鼠麻醉,采用眼科剪打開胸腔,摘取心臟,去除心耳。應(yīng)用生理鹽水灌注沖洗后吸干水分。將標(biāo)本放置到含有2 ml Trlzol試劑的15 ml離心管中保存。

    1.3 RNA提取 在TRIzol試劑中剪碎心臟組織,4℃、12 000r/min離心2 min。將勻漿混合液轉(zhuǎn)入新EP管中,加入400μl的三氯甲烷,劇烈混勻,4℃、12 000 r/min離心15 min;分離上層RNA移至新EP管中,1:1加入異丙醇,4℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清,加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇重懸沉淀;4℃、12 000 r/min離心15 min,棄上清,加入適量DEPC水溶解RNA。Nanodrop 2000測RNA濃度,評價(jià)RNA的完整性。

    1.4 芯片分析 Agilent-085631 RNA芯片及數(shù)據(jù)分析由博淼生物有限公司(Bio Miao Biotechnology Co.,Ltd.中國北京)進(jìn)行。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,合成為cRNA并用Cyanine-3-CTP標(biāo)記后,進(jìn)行微陣列雜交,用安捷倫掃描儀G2505C(Agilent Technologies)掃描陣列。應(yīng)用功能提取軟件(10.7.1.1版,安捷倫科技公司)分析陣列圖像以獲取原始數(shù)據(jù)。使用Genespring(14.8版,Agilent Technologies)完成原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)分析。通過倍數(shù)變化以及t檢驗(yàn)計(jì)算P值。上調(diào)和下調(diào)基因的閾值設(shè)置為倍數(shù)變化≥2.0,P≤0.05。使用GO分析和KEGG分析確定差異circRNA的生物學(xué)功能?;谠撐锓N所有已知miRNA(數(shù) 據(jù) 來 源 于miRBase V22),應(yīng) 用miranda程 序[10]預(yù)測circRNA序列上可能結(jié)合的miRNA,選擇結(jié)合能量<-20 J的已知功能miRNA進(jìn)行相關(guān)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異情況及相關(guān)性 根據(jù)芯片的探針重復(fù)分別計(jì)算質(zhì)控點(diǎn)和非質(zhì)控點(diǎn)的CV值,取對應(yīng)的中位值及表示芯片的變異系數(shù),判斷不同樣本的檢測結(jié)果檢測體系是否穩(wěn)定,一般CV值要求低于15%。本次檢測結(jié)果中平均CV值為8.16%,最大CV值為9.61%,提示基因芯片檢測成功。進(jìn)一步應(yīng)用Pearson Correlation檢驗(yàn)分析樣本間相關(guān)性和主成分,兩組樣本的分布良好,組內(nèi)CV小。見圖1。

    圖1 兩組樣本的主成分分布圖

    2.2 circRNA差異表達(dá)情況分析 根據(jù)分組情況對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并根據(jù)對應(yīng)的閾值(差異倍數(shù)>2,P<0.05)分別進(jìn)行差異circRNA篩選,結(jié)果顯示,乳鼠circRNA表達(dá)上調(diào)38個(gè),circRNA表達(dá)下調(diào)1個(gè)。對差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類,區(qū)分兩組或多組樣本(圖2a)。應(yīng)用火山圖和散點(diǎn)圖展示差異表達(dá)circRNA的差異倍數(shù)及P值分布情況(圖2b、圖2c)。

    圖2 差異表達(dá)circRNA的分布情況(a.乳鼠和成鼠circRNA差異表達(dá)的聚類分析圖;b.乳鼠和成鼠circRNA差異表達(dá)的散點(diǎn)圖;c.乳鼠和成鼠circRNA差異表達(dá)的火山圖)

    2.3 差異表達(dá)circRNA的宿主基因富集分析 本研究僅對差異表達(dá)上調(diào)的circRNA宿主基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析。GO富集分析顯示,上調(diào)表達(dá)的circRNA主要與蛋白激酶和RNA相關(guān)蛋白的反向激活調(diào)控有關(guān),而這些宿主基因最主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控通路與有絲分裂調(diào)控、流體力學(xué)調(diào)控和硫基代謝調(diào)控有關(guān)(P均<0.001)。見圖3。

    圖3 GO富集分析及KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控分析(a.GO富集分析;b.KEGG分析)

    2.4 差異表達(dá)circRNA的互作調(diào)控miRNA分析 根據(jù)芯片分析結(jié)果,獲取差異表達(dá)倍數(shù)>5的circRNA共有5個(gè),分別是上調(diào)表達(dá)的mmu-circ RNA-0001016、mmu-circRNA-0000126、mmu-circRNA-0000663、mmu-circRNA-0000914和下調(diào)表達(dá)的mmu-circRNA-0001718。見表1。

    表1 差異表達(dá)circRNA及互作miRNA分析

    3 討論

    細(xì)胞死亡期作為急性心肌梗死的關(guān)鍵病理分期,貫穿于整個(gè)急性心肌梗死損傷修復(fù)過程[11-12]。circRNA作為一類新型的非編碼RNA,在心肌細(xì)胞增殖調(diào)控中可能發(fā)揮基礎(chǔ)性作用,有望成為急性心肌梗死后促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的潛在靶點(diǎn)。與傳統(tǒng)的線性RNA不同,circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu),由外顯子序列構(gòu)成,不受RNA外切酶影響,表達(dá)更穩(wěn)定,不易降解。功能研究發(fā)現(xiàn),大部分circRNA分子上富含miRNA結(jié)合位點(diǎn),在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用,通過解除miRNA對靶基因的抑制作用改變靶基因的表達(dá)水平,這一作用機(jī)制也被稱為競爭性內(nèi)源RNA[13]。本研究發(fā)現(xiàn),circRNA-0001016、circRNA-0000126和circRNA-0000663對目前已知的可能參與細(xì)胞周期調(diào)控的miRNA家族成員miRNA-15、miRNA-34a和let7有相互作用,提示這些circRNA可能通過競爭性內(nèi)源RNA方式發(fā)揮了對心肌細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。其中,mmu-circRNA-0000914涉及的與增殖有關(guān)的miRNA最多,包括既往研究報(bào)道的與心肌細(xì)胞增殖能力調(diào)控密切相關(guān)的miRNA-195和miRNA-294[14-15]。此 外,mmu-circRNA-0001718表達(dá)下調(diào),且與心肌細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控分子miRNA-128有著明顯的相互作用,這些差異表達(dá)顯著的circRNA可能通過調(diào)控miRNA抑制細(xì)胞增殖,進(jìn)而導(dǎo)致各種心律失常、心肌重構(gòu)和心衰等永久性心肌損傷的發(fā)生。

    綜上所述,與成鼠心肌組織比較,乳鼠存在顯著差異表達(dá)的circRNA,這些差異表達(dá)顯著的circRNA可能通過調(diào)控miRNA抑制細(xì)胞增殖。闡明并進(jìn)行關(guān)鍵circRNA的調(diào)控研究,有可能為心肌細(xì)胞增殖的干預(yù)研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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