基于整合藥理學(xué)預(yù)測(cè)二至丸治療高血壓的分子機(jī)制

李梓源，羅植允，馮晶晶，吳 偉

高血壓是以體循環(huán)動(dòng)脈血壓(收縮壓和/或舒張壓)增高[收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mmHg]為主要特征的心血管疾病，亦是心血管疾病中患病率較高的慢性疾病。長(zhǎng)期高血壓將對(duì)人體心、腦、腎、血管等靶器官造成嚴(yán)重功能損害。我國(guó)高血壓具有患病率高及知曉率、治療率、控制率低特點(diǎn)[1]， 說(shuō)明多數(shù)高血壓病人對(duì)身體健康狀況不甚了解或難以對(duì)病情進(jìn)行控制或治療。目前臨床治療高血壓以西藥為主，西藥雖有較好的臨床療效，便于攜帶，方便服用，但長(zhǎng)期服用降壓藥易產(chǎn)生耐藥性，且西藥有一定的副作用。中藥溫和，對(duì)肝腎毒副作用較小，亦有較好的臨床療效，因此，中藥對(duì)長(zhǎng)期治療并維持血壓的穩(wěn)定具有較大優(yōu)勢(shì)。二至丸出自清代的《醫(yī)方集解》，方中含有女貞子和墨旱蓮，作為平補(bǔ)肝腎之劑，具有補(bǔ)養(yǎng)肝腎、滋陰補(bǔ)血的功效，對(duì)肝腎陰虛證型高血壓具有較好的治療作用，目前二至丸治療高血壓的作用機(jī)制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討二至丸治療高血壓的作用機(jī)制，深入研究二至丸中藥物與治療肝腎陰虛型高血壓的關(guān)系，為二至丸的臨床應(yīng)用提供準(zhǔn)確的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 二至丸有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 分別以“女貞子”“墨旱蓮”為關(guān)鍵詞檢索TCMSP中草藥藥理學(xué)平臺(tái)，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，獲取二至丸中女貞子、墨旱蓮的有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)，應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行g(shù)ene symbol轉(zhuǎn)換，物種設(shè)置為“Homo sapiens”。

1.2 高血壓基因的獲取 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，分別以“hypertension”“high blood pressure”為檢索詞，獲得排名居前2 000位的基因，取并集獲得高血壓基因。

1.3 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將二至丸的相關(guān)靶點(diǎn)與高血壓基因取交集，獲得二至丸治療高血壓的核心靶點(diǎn)，再將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)與基因本體(GO)功能富集分析 將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，分別進(jìn)行KEGG通路富集分析與GO功能富集分析，GO分析涉及分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞組成，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取KEGG通路和GO功能富集分析結(jié)果。

1.5 可視化分析 分別通過(guò)OmicShare數(shù)據(jù)平臺(tái)(www.omicshare.com/tools/)繪制Venn圖，應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 二至丸的活性成分及相關(guān)靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，分別檢索出女貞子119個(gè)有效成分，墨旱蓮48個(gè)有效成分。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，最終得到女貞子活性成分13個(gè)、墨旱蓮活性成分10個(gè)，詳見(jiàn)表1。其中槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)為二者共有成分，可能為二至丸治療高血壓的關(guān)鍵成分。分別檢索女貞子、墨旱蓮的活性成分靶點(diǎn)，共獲得182個(gè)、127個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 二至丸活性成分

2.2 高血壓基因的獲取及核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 基于GeneCards平臺(tái)，分別檢索“hypertension”“high blood pressure”，取并集后共獲得2 637個(gè)基因。將其與二至丸相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共獲得143個(gè)核心基因。詳見(jiàn)圖1。

圖1 二至丸及高血壓基因的Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將143個(gè)核心基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載數(shù)據(jù)后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件。通過(guò)Network Analyzer模塊進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，以Degree值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排序，最終得到10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細(xì)胞介素-6(IL6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、胱天蛋白酶3(CASP3)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、肉瘤病毒17癌基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、MYC基因(MYC)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG與GO富集分析 基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析，共獲得二至丸治療高血壓的20條KEGG關(guān)鍵通路，主要涉及腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等，詳見(jiàn)圖3。GO分析得到15條關(guān)鍵生物途徑，主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、藥物反應(yīng)(response to drug)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)等，詳見(jiàn)圖4。

圖3 核心通路富集圖

圖4 生物途徑GO分析(黃色代表分子功能；綠色代表生物過(guò)程；藍(lán)色代表細(xì)胞組成)

3 討 論

氧化應(yīng)激與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，體內(nèi)活性氧生成過(guò)多，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致血管炎癥，血壓升高。目前，幾乎所有人體研究均表明槲皮素可降低高血壓病人血壓，其機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激[2]，干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)[3]和改善血管內(nèi)皮功能[4]等有關(guān)。

木犀草素是一種常見(jiàn)的黃酮類化合物，可上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)，并減少氧化損傷介質(zhì)丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)等抑制氧化應(yīng)激[5]；并激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/一氧化氮(PI3K/AKT/NO)信號(hào)通路，使內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化增加，增加內(nèi)皮型一氧化氮合成與釋放，從而發(fā)揮舒張血管的作用[6]。木犀草素通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，改善高血壓相關(guān)血管重塑[7]。AKT1是蛋白激酶B(AKT)的亞型之一。有研究顯示，NO生成減少導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損是高血壓發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，由于許多內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑聚集在AKT上，導(dǎo)致eNOS磷酸化和活化，因此該分子可作為增加eNOS反應(yīng)的理想靶點(diǎn)[8]。IL-6、TNF等炎性因子可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分化和膠原生成增加，是構(gòu)成高血壓心肌纖維化的病理生理基礎(chǔ)[9]。VEGFA結(jié)合VEGFR后，通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路增加eNOS磷酸化及其活性，使NO產(chǎn)生增加，血管通透性和內(nèi)皮細(xì)胞存活，并介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張[10]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要的終末剪切酶[11]，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與高血壓病理生理的多個(gè)過(guò)程[12]。

TNF信號(hào)通路具有多種生物學(xué)效應(yīng)，TNF-α過(guò)表達(dá)可損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，使血管內(nèi)膜增生，外周阻力增加。TNF-α可促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)IL-6表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷，血管收縮，血壓升高[13]。HIF-1α和HIF-2α表達(dá)之間的平衡是維持正常組織灌注和全身動(dòng)脈壓的重要因素[14]?？梢?jiàn)，HIF-1信號(hào)通路與血壓關(guān)系密切。PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成和凋亡的重要途徑，參與機(jī)體抗氧化過(guò)程，與左室肥大和血管舒張功能障礙有關(guān)[15]。VEGF信號(hào)通路對(duì)血管生成及維持正常的血管內(nèi)皮功能具有重要的意義。高血壓長(zhǎng)期壓力負(fù)荷產(chǎn)生的機(jī)械牽張刺激使MAPK信號(hào)通路過(guò)度激活，引起心肌細(xì)胞肥大、心肌肥厚，導(dǎo)致高血壓性心臟病發(fā)生[16]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活是血壓調(diào)控的重要機(jī)制，RAS系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有較強(qiáng)的縮血管作用，通過(guò)刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶，促進(jìn)醛固酮分泌，水鈉潴留增加，血壓升高[17]；AngⅡ可增加交感神經(jīng)遞質(zhì)和特異性受體的活性，使血壓升高[18]；AngⅡ可反饋性地抑制腎素分泌并刺激腎臟分泌前列腺素，調(diào)節(jié)血壓水平[19]。心肌和平滑肌收縮取決于細(xì)胞內(nèi)有力鈣離子濃度，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流增加或肌漿網(wǎng)鈣釋放增加，均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，使血管平滑肌收縮增強(qiáng)，血壓升高。

總之，二至丸具有多靶點(diǎn)、多通路治療高血壓的特點(diǎn)，二至丸降壓治療的藥效成分、作用靶點(diǎn)、分子通路可為進(jìn)一步深入揭示其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。