肥料配施對北蒼術(shù)3種倍半萜類成分及2種生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

王孟聰，翁麗麗，孫 金，肖春萍，陳天麗

肥料配施對北蒼術(shù)3種倍半萜類成分及2種生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

王孟聰，翁麗麗，孫 金，肖春萍*，陳天麗*

長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117

探討不同肥料配施對北蒼術(shù)(DC.) Koidz. 3種倍半萜成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇含量及2種生物合成關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy- 3- methylglutarate monoacylase A reductase，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS）活性及基因表達(dá)的影響。在不同的肥料配施下，采用高效液相色譜法測定北蒼術(shù)3種倍半萜類成分的含量，采用試劑盒法（雙抗體夾心法）測定北蒼術(shù)根莖中HMGR和FPPS的活性；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法測定北蒼術(shù)HMGR和FPPS的表達(dá)量；采用SPSS軟件對生物合成關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。適宜的氮磷鉀配施，可促進(jìn)北蒼術(shù)倍半萜類成分的積累，并顯著提高其生物合成關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)。該試驗(yàn)區(qū)所代表的土壤肥力狀況下有利于倍半萜類成分積累的最優(yōu)施肥方案為氮肥（N）180 kg/hm2，磷肥（P2O5）225 kg/hm2，鉀肥（K2O）105 kg/hm2。不同肥料配施下，關(guān)鍵酶基因HMGR與蒼術(shù)酮、β-桉葉醇呈顯著正相關(guān)（＜0.05）；關(guān)鍵酶基因FPPS與白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與蒼術(shù)酮顯著相關(guān)（＜0.05）。優(yōu)化氮磷鉀配施對北蒼術(shù)倍半萜類成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇積累及生物合成關(guān)鍵酶HMGR和FPPS活性及基因表達(dá)作用顯著，北蒼術(shù)根莖中倍半萜類成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇的生物合成受到多種基因及酶的調(diào)控，其中關(guān)鍵酶FPPS發(fā)揮了較大的調(diào)控作用。

北蒼術(shù)；肥料配施；倍半萜；3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶；法呢基焦磷酸合酶；基因表達(dá)；白術(shù)內(nèi)酯II；β-桉葉醇；蒼術(shù)酮

北蒼術(shù)(DC.) Koidz.為菊科多年生草本植物，以干燥根莖入藥[1]。倍半萜類成分是蒼術(shù)屬植物主要化學(xué)成分，主要包括蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II、蒼術(shù)苷A、β-桉葉醇等，具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保肝、抗菌、抗病毒等廣泛的藥理作用，此類成分的提高對于北蒼術(shù)藥材質(zhì)量的控制意義重大[2-4]。研究表明[5-8]，倍半萜類成分多數(shù)通過甲羥戊酸途徑在植物體內(nèi)合成，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS）是倍半萜類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。HMGR對MVA途徑起催化作用，F(xiàn)PPS催化倍半萜化合物的前體化合物法呢基二磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）的合成[9-10]。藥材質(zhì)量與土壤中營養(yǎng)成分組成等密切相關(guān)，氮、磷、鉀是植物生長發(fā)育過程中的重要營養(yǎng)元素，合理配施可以引起植物有效成分性質(zhì)或含量的變化，孫金等[11]研究發(fā)現(xiàn)科學(xué)合理的氮、磷、鉀配施可以促進(jìn)北蒼術(shù)生長和北蒼術(shù)中倍半萜類成分含量的增加，但目前針對肥料配施對北蒼術(shù)中倍半萜類成分生物合成影響的研究較少，作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究以北蒼術(shù)為材料，研究不同肥料配施下北蒼術(shù)根莖中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇3種倍半萜類成分含量以及關(guān)鍵酶HMGR和FPPS活性和基因表達(dá)量，分析北蒼術(shù)倍半萜類與關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)之間的關(guān)系，為闡明肥料配施對北蒼術(shù)倍半萜類成分合成的分子調(diào)控機(jī)制，提高北蒼術(shù)倍半萜類成分含量和品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，并為北蒼術(shù)種植過程中合理的肥料配施提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況及供試材料

選擇前茬作物為玉米的地塊作為試驗(yàn)田，具體位置位于吉林省柳河縣安口鎮(zhèn)北蒼術(shù)種植基地，地理位置125°36′4.94″E，42°12′37.65″N，海拔399 m。對土壤情況進(jìn)行測定：土壤pH為5.65、有機(jī)質(zhì)含量為51.73 g/kg、速效氮、有效磷、速效鉀含量分別為41.89、94.40、143.54 mg/kg。選取長勢相近，葉莖完好，無病蟲害，植株健壯，根系發(fā)達(dá)的一年生北蒼術(shù)苗作為供試材料移栽試驗(yàn)田，由吉林省昌農(nóng)實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司柳河北蒼術(shù)栽培基地提供。經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為北蒼術(shù)(DC.) Koidz. 正品。試驗(yàn)中尿素（N，總氮≥46%）、過磷酸鈣（P2O5，總磷≥46%）、硫酸鉀（K2O，總鉀≥50%）為試驗(yàn)用肥料。

1.2 試劑

對照品蒼術(shù)酮（批號P11M10F73437，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.3%）、β-桉葉醇（批號P24O8F46474，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.4%）、白術(shù)內(nèi)酯II（批號M22A10S95762，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%）均購于上海源葉生物科技有限公司。磷酸、乙腈為色譜純；甲醇分析純；水為超純水。植物通用總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）。植物HMGR ELISA檢測試劑盒、植物FPPS ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考依據(jù)北蒼術(shù)種植基地對北蒼術(shù)的多年種植實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對本實(shí)驗(yàn)的施肥種類和施肥時(shí)間進(jìn)行設(shè)置。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化設(shè)置施肥方案[11]，設(shè)置氮、磷、鉀3個(gè)因素，4個(gè)水平，正交試驗(yàn)方案見表1。設(shè)置10個(gè)不同的施肥處理，3次重復(fù)，30個(gè)小區(qū)，小區(qū)總面積150 m2，每個(gè)小區(qū)3 m2（1.5 m×2.0 m），行株距為15 cm×20 cm，每個(gè)小區(qū)栽種100株北蒼術(shù)。北蒼術(shù)植株于2019年5月25日移栽，移栽前無任何施肥，后期除肥料按設(shè)計(jì)施用外，其他田間管理措施一致。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的施肥種類和施肥量

Table 1 Fertilization types and fertilization amount of orthogonal experiment L9(34)

處理組合施用量/(kg·hm?2) 尿素（N）過磷酸鈣（P2O5）硫酸鉀（K2O） T0N0P0K0 0 0 0 T1N1P1K1 90 75105 T2N1P2K2 90150210 T3N1P3K3 90225315 T4N2P1K2180 75210 T5N2P2K3180150315 T6N2P3K1180225105 T7N3P1K3270 75315 T8N3P2K1270150105 T9N3P3K2270225210

5月下旬（苗期）施入基肥，N肥60.0%、P肥100.0%、K肥33.3%，N、P、K比例為6∶8∶4；6月下旬（營養(yǎng)生長期）和8月下旬（果期）分別進(jìn)行1、2次追肥處理，其中N肥20.0%、K肥33.3%，N、K比均為2∶4。將不同處理組合的氮磷鉀肥用相同體積自來水溶解，均勻噴施于小區(qū)土壤表面。

2.2 樣品的收集

移栽北蒼術(shù)種苗前，隨機(jī)選取其中的200株測定其生長指標(biāo)，計(jì)算其各指標(biāo)平均值則為基礎(chǔ)生物量。取樣時(shí)間是種苗移栽后的第30、60、90、120、150 d，在每個(gè)平行小區(qū)隨機(jī)取樣6株，將取樣后的北蒼術(shù)裝入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，將樣品除去地上部分和須根后進(jìn)行清洗，吸水紙吸干附著水分，其中一部分根莖樣品進(jìn)行分裝、液氮固定，儲(chǔ)存于?80 ℃冰箱備用，另一部分洗凈后室內(nèi)陰干，干燥后粉碎過篩備用。

2.3 含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮適量，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為10.1、33.0、53.4 μg/mL的混合儲(chǔ)備液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 將處理后的北蒼術(shù)藥材粉碎過三號篩，精密稱定0.3 g，參照《中國藥典》2020年版一部蒼術(shù)項(xiàng)下含量測定方法，制備供試品溶液。

2.3.3 蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇含量測定 色譜條件參照本課題組前期建立的北蒼術(shù)一測多評方法[6]。

2.3.4 線性回歸方程的繪制 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合儲(chǔ)備液逐級稀釋成系列濃度（分別為原濃度的1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025倍），取15 μL注入高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。

表2 3種對照品回歸方程和線性范圍

Table 2 Regression equations and linear ranges of three reference substances

成分回歸方程r線性范圍/μg 蒼術(shù)酮Y＝18 717.410 7 X＋1 756.575 80.999 70.020 0～0.801 0 白術(shù)內(nèi)酯IIY＝47 177.499 2 X＋483.693 00.999 90.003 8～0.151 5 β-桉葉醇Y＝30 772.658 2 X＋4 034.467 60.999 50.012 4～0.495 0

2.4 關(guān)鍵酶活性測定

稱取北蒼術(shù)根莖0.2 g，加入1.8 mL預(yù)冷的0.01 mol/L PBS（pH 7.4，NaCl 8 g、Na2HPO41.44 g、KH2PO40.24 g），液氮研磨成勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心20 min。采用試劑盒法（雙抗體夾心法）測定不同肥料配施下北蒼術(shù)根莖中關(guān)鍵酶HMGR和FPPS的活性，操作步驟按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行，2種關(guān)鍵酶HMGR標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定范圍分別為＝0.030 5＋0.075 4，＝0.999 1，線性范圍為0～80 U/L；FPPS標(biāo)準(zhǔn)曲線＝0.004 8＋0.038 2，＝0.999 5，線性范圍為0～400 U/mL。

2.5 關(guān)鍵酶基因表達(dá)量測定

2.5.1 植物總RNA的提取與cRNA的合成 根據(jù)Takara植物通用總RNA提取試劑盒說明書提取北蒼術(shù)根莖總RNA，采用Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀測定樣品RNA濃度及純度，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，?20 ℃儲(chǔ)存，備用。

2.5.2 引物設(shè)計(jì)與合成 以EF-1α為內(nèi)參基因[12]，根據(jù)試驗(yàn)樣品中轉(zhuǎn)錄組篩選出的HMGR和FPPS基因片段，由上海生工設(shè)計(jì)合成引物，引物序列見表3。

2.6 引物特異性檢測

2.6.1 北蒼術(shù)內(nèi)參基因及關(guān)鍵酶基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線 以北蒼術(shù)根莖中cDNA為模板，陰性（NTC）為對照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所得熔解曲線見圖1，結(jié)果表明EF-1α、HMGR和FPPS均為特異性單峰，空白對照無擴(kuò)增，且沒有引物二聚體及非特異性擴(kuò)增干擾，說明本實(shí)驗(yàn)引物具有較高的特異性，符合試驗(yàn)要求。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Table 3 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

基因TRINITY引物序列（5’-3’）產(chǎn)物長度/bp EF-1α 正向ACCAACTGGGTTGACAACTGAAGT 64 反向AGCCTCGGTAAGGGCTTCAT HMGRDN14568正向AACCGCCACCACTCACTCACATTCTTC109 反向GGACGCCGTTGCTTCTGGAC FPPS 正向TCTTGCGTGTGCCCTTGGTTG206 反向TGACCTCTGCGTGTATGGGACTC

A-EF-1α基因 B-HMGR基因 C-FPPS基因

2.6.2 北蒼術(shù)內(nèi)參基因及關(guān)鍵酶基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線與擴(kuò)增效率 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以5倍梯度稀釋北蒼術(shù)根莖組織cDNA后，得到的擴(kuò)增曲線平滑，指數(shù)擴(kuò)增期明顯，得到的北蒼術(shù)內(nèi)參基因和關(guān)鍵酶相關(guān)基因和的相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，其相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率符合試驗(yàn)要求，表明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好。

2.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板，根據(jù)表2中各基因的引物序列，按照20 μL反應(yīng)體系（SYBR?Premix ExTM10.4 μL，10 μmol/LForward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL）及反應(yīng)程序[95 ℃預(yù)變性30 s；40個(gè)循環(huán)（95 ℃變性5 s，64 ℃退火1 min）]對不同肥料配施下北蒼術(shù)和基因表達(dá)量進(jìn)行測定，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。RT-PCR反應(yīng)內(nèi)參基因?yàn)椤?/p>

A-EF-1α基因 B-HMGR基因 C-FPPS基因

2.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的換算和預(yù)處理，計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法[13]進(jìn)行；數(shù)據(jù)分析、各參數(shù)之間的多重比較及圖形繪制等利用SPSS 21.0、GraphPad prism 6.0、Photoshop CC 2018進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 肥料配施對北蒼術(shù)3種倍半萜成分含量的影響

3.1.1 肥料配施對北蒼術(shù)蒼術(shù)酮含量的影響 北蒼術(shù)種苗基礎(chǔ)蒼術(shù)酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.807 4±0.042 1）mg/g。由圖3可知，不同肥料配施下，不同方案的北蒼術(shù)根莖中蒼術(shù)酮含量在移栽的30～120 d時(shí)期整體呈現(xiàn)下降的趨勢，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.968 8～5.249 3 mg/g。移栽150 d時(shí)，各方案下的蒼術(shù)酮含量呈現(xiàn)上升的趨勢，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.355 4～4.525 2 mg/g。T4施肥方案各個(gè)時(shí)期的蒼術(shù)酮含量與同時(shí)期其他組相比，處于較高水平，特別在移栽150 d時(shí)，蒼術(shù)酮含量明顯較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4.525 2 mg/g，是空白組（T0）的1.51倍。綜合分析，采用T4施肥方案，北蒼術(shù)根莖中蒼術(shù)酮含量會(huì)達(dá)到較高水平，說明該施肥方案能夠有效促進(jìn)倍半萜類成分代謝，增加蒼術(shù)酮的合成與積累。

不同字母表示差異性顯著，P＜0.05，下同

3.1.2 肥料配施對北蒼術(shù)β-桉葉醇含量的影響 北蒼術(shù)種苗基礎(chǔ)β-桉葉醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（2.948 8±0.095 8）mg/g。由圖4可知，不同肥料配施下，不同方案北蒼術(shù)根莖中β-桉葉醇在30～150 d呈現(xiàn)下降趨勢，移栽30 d的β-桉葉醇范圍在2.491 5～5.180 5 mg/g。比較各方案30～120 d各個(gè)時(shí)期北蒼術(shù)根莖中β-桉葉醇量，T6方案相對較高，在60、90、120 d的β-桉葉醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到1.013 2、0.817 8、1.388 1 mg/g，是空白組T0的1.35、3.91、8.74倍。移栽150 d較前一時(shí)期整體呈上升趨勢，T6方案仍然處于較高水平，β-桉葉醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.963 3 mg/g，是空白組的1.76倍。由此可知，T6方案北蒼術(shù)根莖中的β-桉葉醇含量在發(fā)育期較高，表明不同肥料配施的比例可能發(fā)揮相似的協(xié)同作用，實(shí)際生產(chǎn)過程中可以通過調(diào)控肥料的用量和配比降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本。

3.1.3 肥料配施對北蒼術(shù)白術(shù)內(nèi)酯II含量的影響 北蒼術(shù)種苗基礎(chǔ)白術(shù)內(nèi)酯II質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.275 7±0.001 7）mg/g。由圖5可知，不同肥料配施下，北蒼術(shù)根莖中白術(shù)內(nèi)酯II的含量變化趨勢與β-桉葉醇相似，不同方案下的北蒼術(shù)根莖中白術(shù)內(nèi)酯II含量在移栽30～150 d時(shí)期整體呈現(xiàn)下降的趨勢。移栽30 d時(shí)的北蒼術(shù)根莖中白術(shù)內(nèi)酯II質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.449 2～0.783 7 mg/ g，其中T6施肥方案下的白術(shù)內(nèi)酯II質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.738 6 mg/g，與其他組相比相對較高。綜合移栽30～150 d各個(gè)時(shí)期，T6方案相對其他方案白術(shù)內(nèi)酯II含量處于較高水平，在30、60、90、120、150 d的白術(shù)內(nèi)酯II質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.738 6、0.607 5、0.461 0、0.445 3、0.638 5 mg/g，是空白組的1.30、1.89、1.08、1.53、1.58倍。綜合上述分析，T6方案施肥下北蒼術(shù)根莖中的白術(shù)內(nèi)酯II含量在發(fā)育期較高，證明該施肥方案可以促進(jìn)倍半萜類成分的合成與積累。

圖4 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)中β-桉葉醇含量的影響()

圖5 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)白術(shù)內(nèi)酯II含量的影響()

3.1.4 不同肥料配施下北蒼術(shù)最佳施肥方案分析 綜合性評價(jià)采收期（即150 d時(shí)）不同肥料配施下的北蒼術(shù)生長狀況，分析方法采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法，隸屬函數(shù)公式如下。當(dāng)某一指標(biāo)與生長狀況呈負(fù)相關(guān)時(shí)，采用公式（2）進(jìn)行計(jì)算[11]。

U（X）=(X－min)/(max－min) （1）

U（X）=1－(X－min)/(max－min) （2）

U（X）為不同肥料配施下北蒼術(shù)某個(gè)測定指標(biāo)，min為該指標(biāo)的最小值，max為該指標(biāo)的最大值。

通過計(jì)算不同肥料配施下北蒼術(shù)各指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值，分析施肥條件對北蒼術(shù)生長的影響。平均隸屬函數(shù)值越大，說明該施肥條件越有利于北蒼術(shù)生長。由表4可知，不同肥料配施下各指標(biāo)的隸屬均值均大于空白組T0，北蒼術(shù)根莖倍半萜類成分含量的隸屬函數(shù)從小到大依次為T0＜T5＜T9＜T8＜T1＜T7＜T4＜T2＜T3＜T6。說明不同肥料配施直接影響北蒼術(shù)根莖倍半萜類成分積累，適宜的氮磷鉀配施可以積極作用北蒼術(shù)生長，基于此分析，T6（N2P3K1）方案效果最優(yōu)。

3.2 肥料配施對2種生物合成關(guān)鍵酶基因活性和表達(dá)量的影響

3.2.1 不同氮、磷、鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶HMGR活性的影響北蒼術(shù)種苗基礎(chǔ)關(guān)鍵酶HMGR活性為（63.38±1.19）U/L。由圖6可知，不同肥料配施下，北蒼術(shù)關(guān)鍵酶HMGR活性在移栽30～90 d呈下降趨勢，90～120 d無顯著變化，移栽150 d較120 d整體呈上升趨勢。移栽150 d時(shí)關(guān)鍵酶HMGR的活性范圍在64.530 0～96.388 0 U/L，達(dá)到了相較于整個(gè)時(shí)期的較高水平。T4施肥方案在移栽30～150 d關(guān)鍵酶HMGR活性較高，特別是移栽60～150 d，關(guān)鍵酶HMGR活性分別是84.857 9、83.273 2、81.579 2、81.415 3 U/L，是空白組T0的1.15、1.29、1.44、1.17倍。縱觀整個(gè)生長期，T4施肥方案下，發(fā)育期內(nèi)HMGR活性相較于其他方案表現(xiàn)為更高水平，推測此方案影響倍半萜類成分的生物合成，說明合理的施肥方案可以提高酶活性，促進(jìn)北蒼術(shù)次生代謝。

表4 不同氮磷鉀配方施肥下北蒼術(shù)根莖倍半萜類成分含量的隸屬函數(shù)分析

Table 4 Membership function analysis of content of sesquiterpenes in rhizomes of A. chinensis under different NPK fertilization

編號質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%隸屬均值 蒼術(shù)酮白術(shù)內(nèi)酯II β-桉葉醇 T000.0300.01 T10.680.320.070.36 T20.761.000.420.73 T30.990.640.690.77 T40.860.100.540.50 T50.340.060.050.15 T61.000.441.000.81 T70.210.600.620.48 T80.4000.540.31 T90.520.070.180.26

圖6 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶HMGR活性的影響()

3.2.2 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶FPPS活性的影響 北蒼術(shù)種苗基礎(chǔ)關(guān)鍵酶FPPS活性為（326.67±8.90）U/mL。根據(jù)圖7可知，不同肥料配施下，移栽30～90 d后關(guān)鍵酶FPPS活性呈現(xiàn)下降趨勢，移栽30d的關(guān)鍵酶FPPS活性差異最顯著，活性范圍426.111 1～582.777 8 U/mL。移栽120～150 d，各方案下的北蒼術(shù)根莖中FPPS活性與90 d相比整體呈上升趨勢。其中T6方案在所有施肥方案中FPPS活性水平相對較高，特別在60～150 d階段，分別為553.333 3、423.958 3、577.916 7、531.388 9 U/mL，是空白組的1.06、1.52、1.16、2.56、1.14倍。由上可知，T6施肥方案下北蒼術(shù)根莖中關(guān)鍵酶FPPS活性較高，結(jié)合對HMGR活性的分析，可以發(fā)現(xiàn)不同酶對倍半萜類成分合成的促進(jìn)作用可能不同，合理的肥料配施對北蒼術(shù)生長發(fā)育有促進(jìn)作用。

3.2.3 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響 基因相對表達(dá)量以種苗基礎(chǔ)表達(dá)量為單位進(jìn)行計(jì)算（下同）。由圖8可知，不同肥料配施下，北蒼術(shù)根莖中關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量在移栽30～120 d呈現(xiàn)下降趨勢。移栽150 d時(shí)，各處理組關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量較前階段整體呈上升趨勢，范圍在2.568 7～11.463 7。

T4施肥方案在移栽30～150 d各個(gè)時(shí)期關(guān)鍵酶HMGR相對表達(dá)量處于較高水平，特別是在移栽60～150 d這個(gè)時(shí)期，T4施肥方案下關(guān)鍵酶基因相對分別是11.9921、9.254 3、6.465 0、7.544 44，是空白組的2.93、2.70、3.43、1.35倍。綜上分析可知，北蒼術(shù)根莖中關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量與活性存在同樣的變化趨勢，即在T4施肥方案下，關(guān)鍵酶基因表達(dá)量發(fā)育期內(nèi)表達(dá)最高，進(jìn)一步說明此方案積極影響倍半萜類成分生物合成。

圖7 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶FPPS活性的影響()

圖8 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶基因HMGR表達(dá)量的影響()

3.2.4 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響 由圖9可知，從整體上看，移栽30～150 d的北蒼術(shù)在不同肥料配比處理下，各方案根莖中關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，且移栽90 d時(shí)，各方案下的關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量較低，范圍為1.570 3～3.971 6。不同方案在移栽120 d和150 d時(shí)關(guān)鍵酶基因FPPS相對表達(dá)量整體呈上升趨勢，T3、T4、T5、T6、T7試驗(yàn)組的關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量在移栽150 d時(shí)較前一時(shí)期增加，范圍在6.789 2～12.705 5。由此分析，不同施肥方案下的北蒼術(shù)根莖中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量變化程度不同，但變化趨勢與其活性的整體變化趨勢相似，證明了關(guān)鍵酶基因的表達(dá)可以調(diào)控酶活性，以便深入研究北蒼術(shù)倍半萜類成分的生物合成。

3.3 肥料配施對北蒼術(shù)3種倍半萜類成分及2種生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)相關(guān)性分析

根據(jù)北蒼術(shù)生長發(fā)育期蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇含量，關(guān)鍵酶HMGR、關(guān)鍵酶FPPS活性及關(guān)鍵酶基因、相對表達(dá)量變化，對北蒼術(shù)3種倍半萜類成分含量和2種生物合成關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

相關(guān)性分析結(jié)果（表5）表明，倍半萜類成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇之間相關(guān)程度不同，其中白術(shù)內(nèi)酯II與β-桉葉醇的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.564），較白術(shù)內(nèi)酯II與蒼術(shù)酮的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.291）更顯著。關(guān)鍵酶HMGR和FPPS活性及相對表達(dá)量之間無顯著相關(guān)關(guān)系，說明了和基因相互獨(dú)立表達(dá)。和基因和相對應(yīng)的酶之間則均表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（＜0.01），其中關(guān)鍵酶FPPS活性與對應(yīng)基因相對表達(dá)量相關(guān)系數(shù)略低（相關(guān)系數(shù)0.495）。根據(jù)3種倍半萜類成分與2種關(guān)鍵酶及基因的相關(guān)性可知，蒼術(shù)酮與關(guān)鍵酶和的基因表達(dá)量均呈顯著相關(guān)（＜0.05），說明北蒼術(shù)根莖中蒼術(shù)酮的合成同時(shí)受到這2種基因的影響。白術(shù)內(nèi)酯II與2種關(guān)鍵酶HMGR和FPPS活性均呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與關(guān)鍵酶HMGR活性相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.395）略小于與FPPS活性相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.500）；白術(shù)內(nèi)酯II與關(guān)鍵酶基因FPPS正相關(guān)關(guān)系較強(qiáng)（＜0.05），說明白術(shù)內(nèi)酯II的生物合成與關(guān)鍵酶FPPS有關(guān)。β-桉葉醇與2種關(guān)鍵酶及其基因相關(guān)程度不同，與關(guān)鍵酶FPPS活性及基因表達(dá)量的相關(guān)性（＜0.01），較與關(guān)鍵酶HMGR活性與基因表達(dá)量的相關(guān)性更顯著（＜0.05），說明關(guān)鍵酶FPPS較HMGR在β-桉葉醇的生物合成中作用更明顯。綜上可知，北蒼術(shù)根莖中倍半萜類成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇的生物合成受到多種基因及酶的調(diào)控，其中關(guān)鍵酶FPPS調(diào)控作用較強(qiáng)。

圖9 不同氮磷鉀配施對北蒼術(shù)關(guān)鍵酶基因FPPS表達(dá)量的影響()

表5 不同氮磷鉀配施下北蒼術(shù)倍半萜類成分與關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量相關(guān)性分析

Table 5 Correlation analysis of sesquiterpene components with key enzyme activities and gene expression in A. chinensisunder different combined applications of nitrogen, phosphorus and potassium

指標(biāo)相關(guān)系數(shù) 蒼術(shù)酮白術(shù)內(nèi)酯IIβ-桉葉醇HMGRFPPSHMGR/EF-1αFPPS/EF-1α 蒼術(shù)酮1.000 0 白術(shù)內(nèi)酯II0.291 0*1.000 β-桉葉醇0.041 70.564**1.000 HMGR0.198 00.395**0.306*1.000 0 FPPS?0.059 70.500**0.659**0.162 01.000 HMGR/EF-1α0.290 0*0.2220.330*0.624 0**0.1311.000 FPPS/EF-1α0.279 0*0.382**0.452**0.067 90.495**0.2191.000

*＜0.05**＜0.01

4 討論

肥效管理是中藥材田間科學(xué)管理的關(guān)鍵要素之一，環(huán)境對于藥用植物的藥效物質(zhì)也起到一定的決定作用，科學(xué)合理的施肥能有效增加藥材產(chǎn)量和改善藥材品質(zhì)[14-15]。逯莉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，用微生物肥和農(nóng)家肥等量配比進(jìn)行施肥，可以獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的黃精。藥用植物的栽培種植不僅要保證經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，更應(yīng)重視藥材內(nèi)在質(zhì)量。研究表明[11]不同氮、磷、鉀配方施肥下北蒼術(shù)根莖中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇的含量均有顯著性增加，而且各有效成分的變化與產(chǎn)量變化均呈正相關(guān)，與氮、磷、鉀的用量變化存在交互效應(yīng)，說明合理的氮、磷、鉀配方施肥可以保證北蒼術(shù)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同氮、磷、鉀配施下北蒼術(shù)在生長發(fā)育過程中，關(guān)鍵酶HMGR和FPPS活性及基因表達(dá)量差異顯著，說明合理施肥對促進(jìn)北蒼術(shù)的次生代謝具有重要作用，對北蒼術(shù)的藥材品質(zhì)有影響。Wang等[17]對藥用植物黃花蒿的研究中發(fā)現(xiàn)基因和基因單個(gè)過表達(dá)及同時(shí)過表達(dá)對倍半萜類成分青蒿素含量的提高均有顯著作用。丁逸雪等[18]對白術(shù)倍半萜成分的研究中發(fā)現(xiàn)高經(jīng)度、低緯度、高海拔的環(huán)境有利于白術(shù)倍半萜成分的積累，說明藥用植物生長發(fā)育具體情況及環(huán)境條件的變化對次生代謝產(chǎn)物積累具有重要作用，對倍半萜的積累量影響顯著。另外，關(guān)鍵酶FPPS及其基因與蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II、β-桉葉醇含量的正相關(guān)關(guān)系，以及在一定的肥料配施下，關(guān)鍵酶HMGR和FPPS活性及其基因表達(dá)量顯著提高，進(jìn)一步說明其在倍半萜類成分合成途徑上具有重要的調(diào)控作用，合理施肥對促進(jìn)北蒼術(shù)的次生代謝具有重要作用。董天旺[19]研究發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥和氮、磷肥合理配施顯著促進(jìn)了太白貝母的生長和生物堿的積累量，說明了科學(xué)合理的肥料配施是藥材品質(zhì)的保障。肖婉君等[20]研究發(fā)現(xiàn)，肥料施用對當(dāng)歸藥材有顯著的增效作用，可以改善藥材性狀，提高當(dāng)歸的產(chǎn)量和質(zhì)量。袁勇等[21]也做過相關(guān)探討，指出科學(xué)施肥，補(bǔ)充營養(yǎng)元素，是提高中藥材質(zhì)量的重要措施，氮、磷、鉀的合理施用可以促進(jìn)營養(yǎng)成分、有效成分的合成與積累。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)北蒼術(shù)根莖中倍半萜類成分蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯II和β-桉葉醇的生物合成受到多種基因及酶的調(diào)控，其中關(guān)鍵酶FPPS發(fā)揮了較大的調(diào)控作用?？茖W(xué)合理的肥料配施可促進(jìn)北蒼術(shù)倍半萜類成分含量的增加，并顯著提高其生物合成關(guān)鍵酶HMGR和FPPS的活性及基因表達(dá)。因此，在北蒼術(shù)的栽培種植過程中，合理的肥料配施可以提高北蒼術(shù)倍半萜成分的積累，保障其質(zhì)量。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 236.

[2] 王藝萌, 王知斌, 孫延平, 等. 蒼術(shù)屬植物中倍半萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(1): 299-309.

[3] 趙建華, 趙重陽, 孫成振, 等. 北蒼術(shù)轉(zhuǎn)錄組分析及倍半萜類生物合成關(guān)鍵基因挖掘 [J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2020, 56(7): 1458-1466.

[4] Yin M, Xiao C C, Chen Y,. A new sesquiterpenoid glycoside from rhizomes of[J]., 2015, 7(4): 371-374.

[5] 李涵, 金香環(huán), 趙百慧, 等. 北蒼術(shù)的化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展 [J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2019(3): 72-73.

[6] 孫金, 翁麗麗, 肖春萍, 等. HPLC-一測多評法結(jié)合色差原理分析不同生長年限北蒼術(shù)藥材的質(zhì)量 [J]. 中國藥房, 2020, 31(11): 1314-1319.

[7] 楊國, 李鴻慧, 金葉飛, 等. 基于轉(zhuǎn)錄組分析白術(shù)倍半萜生物合成的相關(guān)基因 [J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2019, 55(12): 1827-1838.

[8] Figueroa-Balderas R E, García-Ponce B, Rocha-Sosa M. Hormonal and stress induction of the gene encoding common bean acetyl-coenzyme A carboxylase [J]., 2006, 142(2): 609-619.

[9] Qian J Y, Liu Y, Chao N X,. Positive selection and functional divergence of farnesyl pyrophosphate synthase genes in plants [J]., 2017, 18(1): 3.

[10] Liu X M, Tao T T, Meng X X,. Cloning and expression analysis of a farnesyl diphosphate synthase () gene from[J]., 2017, 45(2): 358-364.

[11] 孫金, 翁麗麗, 肖春萍, 等. 氮磷鉀配方施肥對北蒼術(shù)生長及有效成分含量的影響 [J]. 北方園藝, 2021(3): 128-135.

[12] 陸奇杰, 巢建國, 谷巍, 等. 銅脅迫對茅蒼術(shù)3種藥效成分積累及其生物合成2種關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響 [J]. 中草藥, 2019, 50(3): 710-715.

[13] 張濤. 人參及其皂苷生物合成對低溫的生理生態(tài)響應(yīng)機(jī)制研究 [D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019.

[14] Tsusaka T, Makino B, Ohsawa R,. Genetic and environmental factors influencing the contents of essential oil compounds in[J]., 2019, 14(5): e0217522.

[15] 葛陽, 康傳志, 萬修福, 等. 生產(chǎn)中氮肥施用及其對中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的影響 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(8): 1883-1892.

[16] 逯莉, 常暉, 介磊, 等. 不同肥料對黃精藥材品質(zhì)的影響分析 [J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 65(12): 65-67.

[17] Wang Y Y, Jing F Y, Yu S Y,. Co-overexpression of the HMGR and FPS genes enhances artemisinin content inL. [J]., 2011, 5: 3396.

[18] 丁逸雪, 徐繼校, 吳威, 等. HPLC法同時(shí)測定白術(shù)中4種倍半萜 [J]. 中成藥, 2020, 42(4): 927-931.

[19] 董天旺. 氮磷肥與微生物肥料配施對2年生太白貝母生長及品質(zhì)的影響[D]. 西安:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2018.

[20] 肖婉君, 郭鳳霞, 陳垣, 等. 施用有機(jī)肥對當(dāng)歸藥材性狀、產(chǎn)量及抗病性的影響 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2021, 30(3): 189-199.

[21] 袁勇, 黃慧蓮, 劉賢旺. 無機(jī)肥料對中藥有效成分含量的影響 [J]. 江西林業(yè)科技, 2000, 28(1): 29-30.

Effects of combined application of fertilizer on gene expression of three sesquiterpenes and two key biosynthesis enzymes in

WANG Meng-cong, WENG Li-li, SUN Jin, XIAO Chun-ping, CHEN Tian-li

College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117 , China

To investigate the effects of different fertilizer combinations on the contents of sesquiterpene components in, including atractylone, atractylenolide-II and β-eudesmol, and the activities and gene expression of the key enzymes for biosynthesis of 3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase (HMGR) and farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS).Under different fertilizer combinations, the contents of three sesquiterpenes inwere determined by HPLC, and the activities of HMGR and FPPS in rhizomes ofwere determined by kit method (double antibody sandwich method). qRT-PCR was used to determine the expression levels of HMGR and FPPS in. SPSS software was used to analyze the correlation between the activities of key enzymes in biosynthesis and gene expression quantity.The suitable combination of nitrogen, phosphorus and potassium could promote the accumulation of sesquiterpenes in, and significantly improved the activity and gene expression of key enzymes in biosynthesis. The optimal fertilization scheme for sesquiterpene accumulation under the soil fertility condition represented by the test area was N 180 kg/hm2, P2O5225 kg/hm2and K2O 105 kg/hm2. Under different fertilizer combinations, the key enzyme gene HMGR was significantly positively correlated with atractylone and β-eudesmol (< 0.05). The key enzyme gene FPPS was significantly positively correlated with atractylenolide II and β-eudesmol (< 0.01), and significantly correlated with atractylone (< 0.05).The optimization of nitrogen, phosphorus and potassium fertilizer application has an effect on the accumulation of atractylone, atractylenolide II and β-eudesmol in, and also has significant effects on the activities and gene expression of key biosynthesis enzymes of HMGR and FPPS. The biosynthesis of sesquiterpenes atractylone, atractylenolide II and β-eudesmol in rhizomes ofis regulated by a variety of genes and enzymes, and the key enzyme FPPS plays a greater regulatory role.

(DC.) Koidz.; combined application of fertilizer; sesquiterpene; 3-hydroxy-3- ethylglutarate monoacylase A reductase; farnesyl pyrophosphate synthase; gene expression; atractylenolone II; β-eudesmol; atractylenone

R286.2

A

0253 - 2670(2022)13 - 4109 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.024

2021-11-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803649）；吉林省科技廳科技項(xiàng)目（20191102035YY）；吉林省中醫(yī)藥管理局科技項(xiàng)目（2020047）

王孟聰，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)鑒定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及開發(fā)利用。Tel: (0431)81672193 E-mail: 15630714647@163.com

肖春萍，講師，博士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源、栽培理論和資源開發(fā)。Tel: (0431)81672193 E-mail: btxnw@163.com

陳天麗，實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: 18604437775 E-mail: 731116920@qq.com

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