基于NLRP3炎癥小體研究白頭翁湯正丁醇提取物對(duì)白念珠菌定植下小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

王亞?wèn)|，徐志慶，夏 丹，張夢(mèng)翔，汪天明, 3，邵 菁, 3，汪長(zhǎng)中, 3*

? 藥理與臨床 ?

基于NLRP3炎癥小體研究白頭翁湯正丁醇提取物對(duì)白念珠菌定植下小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

王亞?wèn)|1, 2，徐志慶1, 2，夏 丹1, 2，張夢(mèng)翔1, 2，汪天明1, 2, 3，邵 菁1, 2, 3，汪長(zhǎng)中1, 2, 3*

1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012 2. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012 3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012

研究白頭翁湯正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction，BAEB）對(duì)白念珠菌異常定植下的葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的治療作用，以及對(duì)Dectin-1/脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）信號(hào)通路的影響。將105只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DSS組、DSS＋白念珠菌組及BAEB低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg）組和美沙拉嗪（200 mg/kg）組。對(duì)照組小鼠每日自由飲水；DSS組予3% DSS溶液，自由飲用連續(xù)7 d；其他組在DSS組基礎(chǔ)上，在第1、3、5、7天ig白念珠菌（1×108CFU/只）。第8天開(kāi)始分別ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)7 d。每天稱定小鼠質(zhì)量，觀察一般狀態(tài)，收集糞便，采用平板培養(yǎng)法檢測(cè)糞便真菌載荷。末次給藥次日，處死小鼠，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，蘇木素-伊紅（HE）染色法進(jìn)行結(jié)腸組織學(xué)分析；ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18水平；免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織Occludin和閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）表達(dá)；Western blotting檢測(cè)結(jié)腸組織Dectin-1、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Syk、凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cystein-asparate protease-1，cleaved Caspase-1）和NLRP3蛋白表達(dá)。與對(duì)照組和DSS組比較，DSS＋白念珠菌組小鼠糞便培養(yǎng)出更多的白念珠菌（＜0.01）；結(jié)腸黏膜損傷程度嚴(yán)重（＜0.01）；結(jié)腸組織炎癥因子IL-1β、IL-18水平明顯升高（＜0.01）；結(jié)腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)明顯下降（＜0.05）；結(jié)腸組織NLRP3、NF-κB和Dectin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），ASC、cleaved Caspase-1和Syk蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。與DSS＋白念珠菌組相比，BAEB組小鼠腸道白念珠菌顯著減少（＜0.01）；結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18水平下降（＜0.05、0.01）；結(jié)腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.05、0.01）；BAEB低劑量組Syk蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；BAEB中劑量組ASC和Syk蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），NLRP3和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）；BAEB高劑量組NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），ASC蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。BAEB可能通過(guò)抑制白念珠菌異常定植下Dectin-1/Syk通路所介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體過(guò)度活化，進(jìn)而阻斷IL-1β與IL-18的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮抗UC作用。

白念珠菌；潰瘍性結(jié)腸炎；白頭翁湯正丁醇提取物；NLRP3炎癥小體；Dectin-1/Syk信號(hào)通路

白頭翁湯（白頭翁15 g、黃柏12 g、黃連6 g、秦皮15 g）出自《傷寒論》，為中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)推薦治療UC的方藥[3]。臨床研究表明，白頭翁湯對(duì)UC具有良好的療效。體外實(shí)驗(yàn)也證明白頭翁湯正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction，BAEB）對(duì)白念珠菌具有明顯抑制作用[13-14]。本課題組前期也進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BAEB對(duì)于白念珠菌定植下的UC小鼠有著顯著的治療效果。然而，白頭翁湯對(duì)白念珠菌定植下的UC的作用機(jī)制尚不清楚。故本研究擬從腸道白念珠菌的過(guò)度定植角度出發(fā)，通過(guò)檢測(cè)Dectin-1/Syk通路、NLRP3炎癥小體相關(guān)指標(biāo)的變化以及反映腸黏膜屏障功能的Occludin和閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）蛋白表達(dá)情況，探討B(tài)AEB對(duì)UC的作用機(jī)制，以期為可能將BAEB開(kāi)發(fā)為作用機(jī)制新穎、臨床療效顯著的抗UC藥物奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性KM小鼠105只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（皖）2017-001，安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)No.340729210100005024。小鼠于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，明暗交替12 h/12 h，室溫維持20～26 ℃，相對(duì)濕度維持40%～70%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AHUCM-2021007）。

1.2 菌株

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314由中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)。

1.3 藥材

白頭翁、黃柏、黃連、秦皮購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)高家榮主任藥師鑒定分別為毛茛科植物白頭翁(Bge.) Regel的干燥根、蕓香科植物黃皮樹(shù)Schneid的干燥樹(shù)皮、毛茛科植物黃連Franch的干燥根莖和木犀科植物苦櫪白蠟樹(shù)Hance的干燥枝皮。

1.4 藥品與試劑

美沙拉嗪腸溶片（批號(hào)10402226，0.25g/片）購(gòu)自葵花藥業(yè)；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS，批號(hào)S3045）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為01/2021、01/2021）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；β-葡聚糖ELISA試劑盒（批號(hào)202101）購(gòu)自上?？婆d生物科技有限公司；核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗體、凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）抗體、山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)分別為ATTNO2501、ATSAP1701、ATSAP0901）購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；ZO-1抗體、Occludin抗體、F4/80抗體、ECL超敏發(fā)光試劑盒、山羊抗小鼠IgG抗體、β-actin抗體（批號(hào)分別為44h7470、53t8241、44k4122、1824c03、19z2345、54o2802）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；NLRP3抗體、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cystein-asparate protease-1，cleaved Caspase-1）抗體（批號(hào)分別為15101S、4）購(gòu)自美國(guó)CST公司；Syk抗體（批號(hào)104032427）購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；Dectin-1抗體（批號(hào)E0317）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司；RIPA細(xì)胞裂解液（強(qiáng)）、預(yù)染蛋白Marker、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為AUKJH、AUKPW、SPHNU）購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；法國(guó)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基（批號(hào)P002076）購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司；聚山梨酯20（批號(hào)20CS1808）購(gòu)自北京金克隆生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（批號(hào)EZ5679A168）購(gòu)自德國(guó)Biofroxx公司。

1.5 儀器

H1-16kr型高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；K3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；RM2016型組織切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 BAEB的制備

按照文獻(xiàn)方法[9]制備BAEB，在提取過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)白頭翁皂苷B4、秦皮甲素、小檗堿含量，并注意有機(jī)溶劑濃度、有機(jī)溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行質(zhì)量控制[15]。BAEB中主要成分含量見(jiàn)表1。

4) 時(shí)間。當(dāng)浸提時(shí)間<60 min時(shí)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，火龍果果皮甜菜苷類色素提取量呈快速上升趨勢(shì)；浸提時(shí)間為60 min時(shí)，甜菜苷類色素有提取量最高，為4.09 mg/100g；之后呈緩慢下降趨勢(shì)。因此，浸提時(shí)間以60 min最優(yōu)。

2.2 白念珠菌懸液的配制

將白念珠菌接種于裝有液態(tài)沙氏培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h。取出，離心收集后將菌液濃度調(diào)整至1×109CFU/mL備用。

表1 BAEB中主要成分含量

Table 1 Contents of main active components in BAEB

成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g?1) 小檗堿315.26 白頭翁皂苷B4174.81 秦皮甲素46.91 黃連堿19.60 黃柏堿16.78 表小檗堿12.66 藥根堿9.92 秦皮乙素2.39

2.3 白念珠菌異常定植下的小鼠UC模型建立與藥物干預(yù)

參考馬克龍等[16]與Choteau等[17]方法，采用DSS自由飲用結(jié)合ig白念珠菌的方法構(gòu)建白念珠菌定植小鼠UC模型。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DSS組、DSS＋白念珠菌組及BAEB低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg）[18]組和美沙拉嗪（200 mg/kg）組，每組15只。對(duì)照組小鼠自由飲用蒸餾水；DSS組小鼠自由飲用3% DSS溶液，連續(xù)7 d；DSS＋白念珠菌組及各給藥組小鼠自由飲用3% DSS溶液，同時(shí)隔日ig 0.1 mL白念珠菌，連續(xù)4次。第8天，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和DSS組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

2.4 小鼠一般體征觀察和疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）計(jì)算

每日觀察小鼠的精神、飲食、活動(dòng)和毛發(fā)等一般狀況，記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀和便血情況，對(duì)小鼠DAI進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Table 2 Scoring criteria of DAI

得分體質(zhì)量下降率（a）大便性狀肉眼血便 0≤1%顆粒和硬度均適中無(wú)異常 11%＜a≤5%顆粒成形，較軟，不黏附肛門糞便有暗紅色斑點(diǎn) 25%＜a≤10%顆粒軟且黏附于肛門糞便有暗紅色斑點(diǎn)，肛門可見(jiàn)出血 3＞10%不成形，黏附肛門，腹瀉糞便深紅色，肛門周圍有血液黏附

2.5 結(jié)腸長(zhǎng)度、黏膜損傷指數(shù)、組織病理形態(tài)學(xué)觀察及評(píng)分

小鼠麻醉后眼球取血，離心獲取血清，?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌操作下迅速剖開(kāi)腹腔，切取小鼠結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，觀察結(jié)腸水腫、潰瘍等損傷程度，并進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colon mucosa damage index，CMDI）評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：組織無(wú)損傷，0分；局部充血、無(wú)潰瘍，1分；局部充血、腸壁增厚、無(wú)潰瘍，2分；有潰瘍、直徑＜1 cm，3分；潰瘍直徑1～2 cm、腸管與外周無(wú)粘連，4分；潰瘍直徑約1～2 cm、腸管增厚、與外周臟器黏連，5分。切取一部分結(jié)腸，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸病理學(xué)變化，按照文獻(xiàn)方法[19]進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。剩余結(jié)腸組織于?80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Table 3 Scoring criteria of colonic histopathology

得分炎癥程度炎癥范圍隱窩損失程度 0無(wú)無(wú)無(wú) 1輕度固有層基底1/3受損 2中度黏膜和黏膜下層基底2/3受損，表面上皮完整 3重度透壁整個(gè)隱窩和上皮丟失

2.6 腸道白念珠菌載荷量評(píng)估

收集各組小鼠第1、5、9、13天的糞便，干燥、稱定質(zhì)量后，重懸于預(yù)冷的PBS中，涂布在含有雙抗的科瑪嘉顯色固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)平板上白念珠菌微菌落的數(shù)量。

2.7 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)

腸組織石蠟切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫封閉10 min，檸檬酸鹽緩沖液微波輻射抗原修復(fù)，羊血清封閉。分別加入Occludin（1︰100）、ZO-1（1︰100）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，37 ℃孵育30 min，加入SABC和DAB顯色劑后，經(jīng)蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。于顯微鏡下觀察，棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.8 ELISA檢測(cè)結(jié)腸組織IL-1β、IL-18水平

取各組小鼠結(jié)腸組織，稱定質(zhì)量，加適量PBS，勻漿，離心，收集上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-1β、IL-18水平。

2.9 Western blotting法檢測(cè)結(jié)腸組織NLRP3、Dectin-1、Syk、NF-κB、ASC和cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)

取結(jié)腸組織，加液氮后用研缽研碎，根據(jù)組織蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取蛋白樣品。BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后，以TBST漂洗，分別加入Dectin-1（1∶1000）、NF-κB（1∶2000）、Syk（1∶10 000）、ASC（1∶2000）、cleaved Caspase-1（1∶1000）、NLRP3（1∶1000）和β-actin（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000），室溫孵育2 h，漂洗后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并進(jìn)行灰度分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用表示。采用單因素方差（One-way ANOVA）分析和LSD檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)用Dunnett’s3檢驗(yàn)）對(duì)組間變量進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果

3.1 BAEB對(duì)小鼠一般狀態(tài)和DAI的影響

對(duì)照組小鼠毛發(fā)色澤、飲食、精神、大便均正常；DSS組小鼠在自由飲用DSS溶液3 d后，出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、食欲減退和稀便，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，癥狀逐漸加重，出現(xiàn)黏液便和血便，DAI逐漸增大（表4）；DSS＋白念珠菌組小鼠的癥狀和體征與DSS組相似，但出現(xiàn)稀便和血便的時(shí)間更早，DAI升高更明顯，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有顯著差異（＜0.01）；第8天，經(jīng)BAEB和美沙拉嗪治療，上述癥狀均得到不同程度的改善，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，DAI開(kāi)始下降，與同時(shí)間點(diǎn)DSS＋白念珠菌組相比有顯著差異（＜0.05）。在治療組中，BAEB中、高劑量組DAI下降較明顯，效果優(yōu)于BAEB低劑量組。BAEB中、高劑量組之間無(wú)差別。說(shuō)明BAEB可以降低白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠DAI評(píng)分，并且隨劑量增加而降低，但當(dāng)劑量達(dá)到一定程度后，效果不再增加。

3.2 BAEB對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、CMDI、組織病理學(xué)和評(píng)分的影響

如表5所示，與對(duì)照組相比，DSS＋白念珠菌組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（＜0.01）；BAEB組和美沙拉嗪組結(jié)腸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于DSS＋白念珠菌組（＜0.05、0.01）；DSS＋白念珠菌組結(jié)腸黏膜水腫、潰瘍和糜爛，黏膜下見(jiàn)大量炎性浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞破損，杯狀細(xì)胞核腺體減少或排列不整齊（圖1），CMDI和組織病理學(xué)評(píng)分升高，與對(duì)照組相比有明顯差異（＜0.01）；BAEB治療后，小鼠結(jié)腸黏膜水腫、糜爛和潰瘍明顯減輕，上皮細(xì)胞破損明顯減少，杯狀細(xì)胞核腺體排列不整齊明顯改善，CMDI和組織病理學(xué)評(píng)分降低，與DSS＋白念珠菌組相比有顯著差異（＜0.05、0.01）。BAEB可以明顯改善白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度及CMDI評(píng)分，且呈劑量相關(guān)性，其中BAEB中、高劑量組效果優(yōu)于美沙拉嗪組。組織病理學(xué)評(píng)分以BAEB中劑量組降低最明顯，說(shuō)明BAEB可以改善白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC，并隨劑量增加而增加，但當(dāng)劑量達(dá)到一定程度后，效果不再增加。

表4 BAEB對(duì)白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠DAI評(píng)分的影響(, n = 15)

Table 4 Effect of BAEB on DAI score in UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)DAI評(píng)分 第1天第4天第7天第10天第13天 對(duì)照—00000 DSS—01.20±0.452.50±0.711.71±1.111.25±0.50 DSS＋白念珠菌—01.00±03.63±1.19##2.33±0.58#1.33±0.58# BAEB2001.14±0.383.57±1.812.00±0.00*1.25±0.50* 4001.00±0.293.00±0.821.57±0.79*1.00±0* 8001.43±0.533.30±1.341.33±0.52*1.00±0* 美沙拉嗪20001.00±03.50±1.222.00±1.41*1.33±0.58

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與DSS＋白念珠菌組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01DSS +s group, same as below tables

表5 BAEB對(duì)白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、CMDI評(píng)分和組織病理學(xué)評(píng)分的影響(, n = 15)

Table 5 Effect of BAEB on colon length,CMDI scores and histopathological score in UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)結(jié)腸長(zhǎng)度/cmCMDI評(píng)分組織病理學(xué)評(píng)分 對(duì)照—11.6±0.400 DSS—10.3±0.7##2.25±1.26##2.50±0.24## DSS＋白念珠菌—9.5±0.9##2.00±1.41##2.67±0.33## BAEB2010.4±0.3*2.33±1.150.78±0.19* 4010.9±0.3**1.00±1.00*0.44±0.19** 8011.4±0.6**0.67±0.58**0.56±0.19** 美沙拉嗪20010.6±0.7*2.33±1.151.11±0.38

A-對(duì)照組 B-DSS組 C-DSS＋白念珠菌組 D-美沙拉嗪組 E-BAEB低劑量組 F-BAEB中劑量組 G-BAEB高劑量組，下圖同

3.3 BAEB對(duì)小鼠腸道白念珠菌載荷的影響

收集小鼠第1、5、9、13天的糞便，在科瑪嘉的培養(yǎng)板上培養(yǎng)，長(zhǎng)出的藍(lán)色光滑菌落是白念珠菌。如表6所示，DSS＋白念珠菌組小鼠糞便白念珠菌增多，與對(duì)照組相比有顯著差異（＜0.01）；第8天給予BAEB后，白念珠菌在腸道定植能力下降，菌落形成單位（colony forming units，CFU）隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小，各治療組與同時(shí)間點(diǎn)DSS＋白念珠菌組相比有明顯下降（＜0.01）；第13天BAEB中、高劑量組與DSS＋白念珠菌組相比CFU明顯下降（＜0.01）。因此，BAEB降低DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸CFU，呈劑量相關(guān)性。

表6 BAEB對(duì)白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠腸道白念珠菌載荷的影響(, n = 15)

Table 6 Effect of BAEB on intestinal Candida albicans load in UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)CFU 第1天第5天第9天第13天 對(duì)照—0000 DSS—0000 DSS＋白念珠菌—0233.50±8.32##328.67±17.82##66.00±1.73## BAEB200268.00±32.11193.67±25.04**58.33±14.84 400246.00±45.21173.33±11.18**53.50±2.83** 800266.50±27.78128.00±22.02**40.33±10.05** 美沙拉嗪2000277.00±39.88202.75±16.62**60.17±5.01

3.4 BAEB對(duì)結(jié)腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖2、3所示，Occludin和ZO-1的表達(dá)定位于腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，鏡下呈棕色。DSS＋白念珠菌組Occludin和ZO-1陽(yáng)性表達(dá)均降低。給予BAEB治療后，Occludin和ZO-1陽(yáng)性表達(dá)上升，以BAEB低、中劑量組效果明顯（＜0.05、0.01）。說(shuō)明BAEB低劑量下可明顯促進(jìn)Occludin和ZO-1的表達(dá)，且效果與美沙拉嗪相似。

3.5 BAEB對(duì)小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和IL-18水平的影響

如表7所示，與對(duì)照組相比，DSS組與DSS＋白念珠菌組小數(shù)結(jié)腸組織中促炎因子IL-1β、IL-18水平明顯升高（＜0.01）；與DSS＋白念珠菌組相比，BAEB各劑量組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18水平均明顯降低（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與DSS＋白念珠菌組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 BAEB對(duì)白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸組織Occludin蛋白表達(dá)的影響(×200)

表7 BAEB對(duì)白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸組織IL-1β和IL-18水平的影響(, n = 15)

Table 7 Effect of BAEB on IL-1β and IL-18 levels in colon tissue of UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)IL-1β/(pg·mg?1)IL-18/(pg·mg?1) 對(duì)照—0.68±0.060.72±0.04 DSS—1.24±0.09##1.22±0.09## DSS＋白念珠菌—1.28±0.04##1.23±0.25## BAEB201.15±0.07*1.06±0.05* 401.18±0.06*1.12±0.04* 801.08±0.06**1.04±0.08* 美沙拉嗪2001.02±0.05**1.02±0.06*

3.6 BAEB對(duì)小鼠結(jié)腸組織Dectin-1、NF-κB、Syk、ASC、cleaved Caspase-1和NLRP3蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，DSS＋白念珠菌組小鼠結(jié)腸組織NLRP3、NF-κB和Dectin-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），ASC、cleaved Caspase-1和Syk蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），且DSS＋白念珠菌組的變化較DSS組明顯；與DSS＋白念珠菌組相比，BAEB低劑量組Syk蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；BAEB中劑量組ASC和Syk蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），NLRP3和NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；BAEB高劑量組ASC蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

目前公認(rèn)UC的發(fā)病機(jī)制與腸道菌群失衡及腸道免疫功能紊亂密切相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸道內(nèi)菌群多樣性明顯降低，白念珠菌比例顯著增加[20]，白念珠菌在腸道過(guò)度定植與UC病情程度呈強(qiáng)相關(guān)性。但是目前對(duì)腸道真菌菌群的研究相對(duì)較少[21]。

圖4 BAEB對(duì)白念珠菌定植的DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸組織NLRP3、Syk、NF-κB、Dectin-1、ASC和cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

本研究中，通過(guò)飲用DSS結(jié)合ig白念珠菌構(gòu)建白念珠菌異常定植下的小鼠UC模型。結(jié)果顯示，DSS＋白念珠菌組小鼠糞便培養(yǎng)出的白念珠菌遠(yuǎn)多于對(duì)照組和DSS組，且小鼠結(jié)腸黏膜損傷程度、血清和組織炎癥因子水平均明顯高于對(duì)照組和DSS組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。給予BAEB治療7 d后，小鼠的便溏便血、體質(zhì)量下降和結(jié)腸長(zhǎng)度縮短等體征得到顯著改善，DAI評(píng)分明顯下降，結(jié)腸黏膜的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞損傷、腺體紊亂和消失的現(xiàn)象有所減輕，腸道白念珠菌CFU數(shù)明顯減少，反映腸黏膜屏障功能的Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)增加。結(jié)果提示，BAEB對(duì)白念珠菌定植的UC小鼠具有抑制腸道白念珠菌增殖、保護(hù)腸道黏膜屏障、減輕腸道炎癥損傷的作用。

腸道白念珠菌過(guò)度定植時(shí)，白念珠菌通過(guò)轉(zhuǎn)位激活腸黏膜組織內(nèi)巨噬細(xì)胞NLRP3的表達(dá)、Caspase-1的活化和IL-1β、IL-18的分泌[22]，以NLRP3炎性小體依賴性方式誘導(dǎo)初級(jí)巨噬細(xì)胞成熟并分泌IL-1β、IL-18[23]。炎癥小體是一類由胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合體，能夠識(shí)別病原體表面的病原相關(guān)分子模式或者宿主來(lái)源的危險(xiǎn)信號(hào)分子。當(dāng)免疫細(xì)胞受到刺激時(shí)，炎癥小體各組分結(jié)合成復(fù)合物，隨后經(jīng)過(guò)一系列酶解反應(yīng)，產(chǎn)生和釋放大量促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18。其中，對(duì)炎癥小體的研究目前以NLRP3為最多[24]。

NLRP3炎癥小體復(fù)合物由識(shí)別分子NLRP3、接頭分子ASC和效應(yīng)分子Caspase-1等組成。當(dāng)免疫細(xì)胞被細(xì)菌、真菌、病毒等病原體的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、尿酸晶體、β淀粉樣纖維等損傷相關(guān)分子模式分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）刺激時(shí)，NLRP3炎癥小體被激活。隨后NLRP3自身寡聚化，招募并活化ASC，ASC活化形成大分子的二聚體，招募并活化Caspase-1前體?；罨腃aspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生IL-1β和IL-18并釋放，引起宿主炎癥反應(yīng)[25]。本研究中，DSS＋白念珠菌組小鼠結(jié)腸組織促炎因子IL-1β和IL-18水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明在DSS誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上伴有白念珠菌的定植會(huì)加重UC的炎癥反應(yīng)，可能與激活結(jié)腸黏膜組織內(nèi)巨噬細(xì)胞，觸發(fā)NLRP3炎癥小體活化，釋放大量炎性因子IL-1β和IL-18，造成結(jié)腸黏膜組織炎性損傷有關(guān)。白念珠菌異常定植可能參與這一過(guò)程。給予BAEB治療后，小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18水平降低，結(jié)腸黏膜組織炎性損傷有所減輕，推測(cè)BAEB可能是通過(guò)阻斷NLRP3炎癥小體活化及相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制IL-1β、IL-18釋放并抑制白念珠菌定植，從而發(fā)揮作用。

真菌感染時(shí)，巨噬細(xì)胞內(nèi)Dectin-1/Syk通路得以激活，并介導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，產(chǎn)生IL-1β、IL-18，但大量IL-1β、IL-18的產(chǎn)生會(huì)引起相應(yīng)組織的炎性損傷。為證實(shí)BAEB可能通過(guò)靶向Dectin-1/Syk通路及其介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體從而抑制IL-1β、IL-18釋放以緩解UC的作用機(jī)制，檢測(cè)Dectin-1/Syk通路中相關(guān)蛋白與NLRP3炎癥小體的表達(dá)。白念珠菌細(xì)胞壁成分β-1,3-葡聚糖作為PAMP被宿主免疫細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞上的模式識(shí)別受體Dectin-1識(shí)別。Dectin-1是膜相關(guān)C型凝集素受體家族的最重要成員。當(dāng)Dectin-1結(jié)合β-1,3-葡聚糖后，其胞內(nèi)的免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）中的酪氨酸首先被Src家族激酶磷酸化，繼而招募Syk，Syk磷酸化后可激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）/Ca2+，促使蛋白激酶Cδ（protein kinase Cδ，PKCδ）活化，誘導(dǎo)Ca2+/活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）/NLRP3炎癥小體的合成，即白念珠菌β-1,3-葡聚糖可通過(guò)Dectin-1/Syk信號(hào)通路活化NLRP3炎癥小體，進(jìn)而產(chǎn)生大量IL-1β與IL-18。因此，該信號(hào)通路被視為白念珠菌感染引起NLRP3炎癥小體活化造成免疫炎癥性損傷的一個(gè)重要干預(yù)靶標(biāo)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予BAEB治療后，Dectin-1、NF-κB、NLRP3表達(dá)呈不同程度地降低，ASC、Syk和cleaved Caspase-1表達(dá)上升。結(jié)果表明，BAEB可能通過(guò)抑制Dectin-1、NF-κB、NLRP3等蛋白的表達(dá)，抑制ASC二聚體化及Syk磷酸化等，抑制Dectin-1/Syk通路介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體過(guò)度活化，進(jìn)而阻斷IL-1β與IL-18的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮抗UC作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的BAEB治療效果存在差異。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，以BAEB中劑量的作用效果較明顯且穩(wěn)定。說(shuō)明BAEB在治療白念珠菌異常定植下的小鼠UC時(shí)，治療效果無(wú)劑量相關(guān)性，其作用效果有一個(gè)最佳藥物劑量。

綜上所述，BAEB通過(guò)抑制白念珠菌定植，促進(jìn)黏膜上皮修復(fù)，減輕結(jié)腸黏膜損傷與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減少促炎因子IL-1β和IL-18的分泌，從而發(fā)揮對(duì)白念珠菌異常定植下的UC的治療作用，其作用機(jī)制可能與BAEB抑制巨噬細(xì)胞Dectin-1/Syk通路介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體過(guò)度活化有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction on ulcerative colitis in mice colonized bybased on NLRP3 inflammasome

WANG Ya-dong1, 2, XU Zhi-qing1, 2, XIA Dan1, 2, ZHANG Meng-xiang1, 2, WANG Tian-ming1, 2, 3, SHAO Jing1, 2, 3, WANG Chang-zhong1, 2, 3

1. School of Integrated Traditional and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2. Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 3. Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China

To observe the therapeutic effect of butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction (BAEB) on ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS) stimulated by abnormal colonization ofin mice and Dectin-1/spleen tyrosine kinase (Syk)/NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3) signaling pathway.A total of 105C57BL/6 mice were randomly divided into control group, DSS group, DSS +group and BAEB low-, medium- and high-dose (20, 40, 80 mg/kg) groups and mesalazine (200 mg/kg) group. Mice in control group were given free access to water every day; DSS group was given 3% DSS solution for seven consecutive days; Other groups were ig(1×108CFU) on 1st, 3rd, 5th, and 7th days on basis of DSS group. On 8th day, mice were ig corresponding drugs, once a day for seven consecutive days. Body weight of mice was weighed every day, general state was observed, feces were collected, and fecal fungal load was detected by plate culture method. The day after last administration, mice were sacrificed, colon length was measured, and hematoxylin-eosin (HE) staining was used for colon histological analysis; ELISA was used to detect the inflammatory factor interleukin-1β (IL-1β) and IL-18 levels in colon tissue; Immunohistochemistry was used to detect the expression of Occludin and zonula occludens-1 (ZO-1) in colon tissue; Western blotting was used to detect protein expressions of Dectin-1, nuclear factor-κB (NF-κB), Syk, apoptosis-associated speck-like protein containing CARD (ASC), cleaved cystein-asparate protease-1 (cleaved Caspase-1) and NLRP3 in colon tissue.Compared with control group and DSS group, morewere cultured in feces of mice in DSS +group (< 0.01); Degree of colonic mucosal injury was severe (< 0.01); Inflammatory factors IL-1β and IL-18 levels in colon tissue were significantly increased (< 0.01); Occludin and ZO-1 protein expressions in colon tissue were significantly decreased (< 0.05); NLRP3, NF-κB and Dectin-1 protein expressions in colon tissue were significantly increased (< 0.01), ASC, cleaved Caspase-1 and Syk protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01). Compared with DSS +group, number of colony-forming units (CFU) ofin intestinal tract of mice in BAEB group was decreased (< 0.01); Levels of IL-1β and IL-18 in colon tissue were decreased (< 0.05, 0.01); Occludin and ZO-1 protein expressions in colon tissue were increased (< 0.05, 0.01); Syk protein expression in low-dose BAEB group was significantly decreased (< 0.01); ASC and Syk protein expressions in BAEB medium-dose group were significantly increased (< 0.05, 0.01), NLRP3 and NF-κB protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01); NF-κB protein expressions in BAEB high-dose group was significantly decreased (< 0.01), ASC protein expression was significantly increased (< 0.01).BAEB may exert anti-UC effect by inhibiting the overactivation of NLRP3 inflammasome mediated by Dectin-1/Syk pathway under abnormalcolonization, thereby blocking the production of IL-1β and IL-18.

; ulcerative colitis; butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction (BAEB); NLRP3 inflammasome; Dectin-1/Syk signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)13 - 3997 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.013

2022-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81774034）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573725）；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（1808085QH286）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（2019zrzd04）；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2017A301，KJ2018A0276）

王亞?wèn)|（1980—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幙垢腥九c免疫。Tel: 13855102327 E-mail: 13855102327@qq.com

汪長(zhǎng)中，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥抗感染與免疫研究。E-mail: ahwcz63@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]