蛇足石杉內(nèi)生真菌Penicillium chrysogenum MT-40的代謝產(chǎn)物研究

賈放放，齊博文，張蓓蓓，王雯靜，王 陽(yáng)，石璠鈺，劉 曉，朱枝祥，王 娟*，史社坡*

蛇足石杉內(nèi)生真菌MT-40的代謝產(chǎn)物研究

賈放放1, 2，齊博文1，張蓓蓓1，王雯靜1，王 陽(yáng)1，石璠鈺1，劉 曉1，朱枝祥1，王 娟1*，史社坡1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029 2. 高平市中醫(yī)醫(yī)院，山西 高平 048400

研究蛇足石杉內(nèi)生真菌MT-40的代謝產(chǎn)物。利用硅膠、Sephadex LH-20及半制備液相色譜等方法進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)及IR、MS、NMR等數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；利用體外模型進(jìn)行抑制血小板ATP釋放及抗乙酰膽堿酯酶活性篩選。從MT-40固體發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物中分離得到了20個(gè)化合物，分別鑒定為(±)--(3a,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,13a-dodecahydrocyclododeca []oxazol- 2-yl)-4-hydroxybenzamide（1）、cyclo-(Trp-Tyr)（2）、cyclo-(Trp-Phe)（3）、meleagrin（4）、alternariol（5）、alternariol methyl ether（6）、altenuene（7）、koninginin B（8）、koninginin F（9）、koninginin D（10）、過氧化麥角甾醇（11）、β谷甾醇（12）、volemolide（13）、4-hydroxy-17-methylincisterol（14）、4-hydroxy-3,6-dimethyl-2-pyran-2-one（15）、對(duì)羥基苯甲酸（16）、對(duì)羥基苯甲醛（17）、香草酸（18）、對(duì)羥基苯乙酸（19）、酪醇（20）?；衔?為新化合物，命名為(±)-盤尼西堿A；化合物5在100 μmol/L時(shí)有一定的抑制血小板釋放ATP作用，抑制率為（40.6±5.2）%；所有化合物在100 μmol/L時(shí)未表現(xiàn)出乙酰膽堿酯酶抑制活性。

蛇足石杉；內(nèi)生真菌；產(chǎn)黃青霉菌；生物堿；聚酮；(±)-盤尼西堿A；alternariol

植物內(nèi)生真菌（endophyte）是指一類部分或全部生活史存在于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物[1]。由于寄主植物的不同及其生存環(huán)境的差異，植物內(nèi)生菌的種類多樣、數(shù)目龐大，且在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了豐富的代謝系統(tǒng)，使其次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、類群豐富、生物活性顯著。目前從植物內(nèi)生菌中分離鑒定的化合物包括生物堿、萜類、蒽醌、𠮿酮、甾醇、多肽等多種成分，并發(fā)現(xiàn)了一系列具有活性的天然產(chǎn)物，如具有動(dòng)物神經(jīng)毒性的麥角生物堿和吲哚生物堿，具有植物抗毒素樣作用的細(xì)胞松弛素，以及其他活性物質(zhì)，包括抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等天然化合物。這些代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)豐富多樣，是活性天然產(chǎn)物的重要來源之一[2-6]。因此，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究對(duì)于發(fā)現(xiàn)更多結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物具有重要意義。

蛇足石杉(Thunb. ex Murray) Trev.為石杉科石杉屬多年生草本蕨類植物，全草具有散瘀消腫、清熱解毒的功效。蛇足石杉各個(gè)組織中含有豐富的內(nèi)生真菌，文獻(xiàn)報(bào)道從部分蛇足石杉來源的內(nèi)生真菌中分離得到了生物堿、倍半萜、多肽等多種化合物[7-12]，但是相對(duì)于蛇足石杉中所含有的豐富的內(nèi)生菌來說，目前這些內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的研究明顯不足。因此，進(jìn)一步挖掘蛇足石杉內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物，有望發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物。在前期研究中，本課題組對(duì)蛇足石杉中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)部分真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物[13-16]。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)蛇足石杉內(nèi)生真菌MT-40進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，固體發(fā)酵培養(yǎng)后分離鑒定了20個(gè)化合物，分別為(±)--(3a,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,13a-dodecahydrocyclododeca[]oxazol-2-yl)-4-hydroxybenzamide（1）、cyclo-(Trp-Tyr)（2）、cyclo-(Trp-Phe)（3）、meleagrin（4）、alternariol（5）、alternariol methyl ether（6）、altenuene（7）、koninginin B（8）、koninginin F（9）、koninginin D（10）、過氧化麥角甾醇（ergosterol peroxide，11）、β-谷甾醇（βsitosterol，12）、volemolide（13）、4-hydroxy-17-methylincisterol（14）、4- hydroxy-3,6-dimethyl-2-pyran-2-one（15）、對(duì)羥基苯甲酸（-hydroxybenzoic acid，16）、對(duì)羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，17）、香草酸（4- hydroxy-3-methoxybenzoic acid，18）、對(duì)羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，19）、酪醇（tyrosol，20）。其中化合物1為新化合物，命名為(±)-盤尼西堿A。并對(duì)分離鑒定的化合物進(jìn)行了抑制血小板釋放ATP活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究。

1 儀器與材料

Autopol IV全自動(dòng)旋光儀（美國(guó)Rudolf公司）；UV-2401PC紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；470 FT-IR紅外光譜儀（美國(guó)Thermo公司）；XT4顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京科儀電光儀器廠）；高效液相離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜分析系統(tǒng)：UFLC SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD M20A紫外檢測(cè)器，LC-20ADXR泵，IT-TOF-MS配備ESI離子源（日本Shimadzu公司）；Varian 500核磁共振儀（美國(guó)Varian公司）；Waters 2998半制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；ODS半制備柱（SunFireTMC18，150 mm×10 mm，5 μm）；Sephadex LH-20填料（瑞典Amerasham Biosciences公司）；ODS柱色譜填料（Li-Chroprep RP-C18，40～63 μm，德國(guó)Merck公司）；D101大孔樹脂、柱色譜用硅膠（200～300目）及薄層色譜用GF254硅膠預(yù)制板均為青島海洋化工廠生產(chǎn)。M1000型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)TECAN公司）；碘代硫代乙酰膽堿、5,5-二硫代二硝基苯甲酸、二甲基亞砜、十二烷基硫酸鈉、熒光素酶原液、ATP、凝血酶均由Sigma公司提供；D-熒光素鈉鹽購(gòu)于北京百靈威科技有限公司；HBSS緩沖液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS）購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；石杉?jí)A甲（批號(hào)80/100629）購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；電鰻乙酰膽堿酯酶由上海源葉生物公司提供。

蛇足石杉(Thunb ex Murray) Trev.采自福建省南平市（標(biāo)本編號(hào)201507）。本研究所用菌株由課題組自蛇足石杉中分離，根據(jù)其形態(tài)特征及ITS rDNA序列鑒定為產(chǎn)黃青霉菌，菌種保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代研究中心（菌種編號(hào)MT-40）。

2 內(nèi)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的提取分離

MT-40于無(wú)菌環(huán)境下接種至0.5 L×40瓶糙米培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)40 d后，用醋酸乙酯超聲提取6次。提取液合并濾過，減壓濃縮得浸膏提取物130 g。經(jīng)正相硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（10∶1→0∶1）、二氯甲烷-甲醇（20∶1→0∶1）梯度洗脫，合并得到10個(gè)流分（Fr. A～J）。Fr. D經(jīng)過正相硅膠柱色譜分離，收集合并相同部分，得到7個(gè)流分（Fr. D1～D7），其中Fr. D3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物19（2.5 mg；流動(dòng)相為甲醇-水90∶10）和16（2.5 mg；流動(dòng)相為甲醇-水90∶10）；Fr. D4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物5（2.8 mg；流動(dòng)相：甲醇-甲酸水80∶20）；Fr. D5經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物6（2.5 mg；流動(dòng)相為甲醇-甲酸水70∶30）；Fr. D6經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物13（2.0 mg；流動(dòng)相為乙腈-甲酸水45∶55）和14（1.9 mg；流動(dòng)相為乙腈-甲酸水45∶55）；Fr. D7用正相硅膠柱色譜反復(fù)進(jìn)行梯度洗脫，得到化合物11（5.0 mg）和12（3.5 mg）。Fr. E經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，收集合并相同部分，得到5個(gè)流分（Fr. E1～E5），其中Fr. E3經(jīng)反相ODS液相色譜并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物1（2.5 mg；流動(dòng)相為甲醇-水65∶35）和8（2.3 mg；流動(dòng)相為甲醇-水50∶50）；Fr. E4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物15（2.9 mg；流動(dòng)相為甲醇-甲酸水45∶55）、17（2.5 mg；流動(dòng)相為甲醇-甲酸水45∶55）、18（2.4 mg；流動(dòng)相為甲醇-甲酸水25∶75）和20（2.4 mg；流動(dòng)相為甲醇-甲酸水25∶75）。Fr. F經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，收集合并相同部分，得到5個(gè)流分（Fr. F1～F5），其中Fr. F3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物7（2.8 mg；流動(dòng)相為甲醇-水50∶50）；Fr. F4經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶得到化合物4（20.0 mg）；Fr. F5經(jīng)反相ODS液相色譜并結(jié)合半制備液相色譜分離純化得到化合物2（1.9 mg；流動(dòng)相為乙腈-甲酸水45∶55）、3（1.5 mg；流動(dòng)相為乙腈-甲酸水45∶55）、9（2.8 mg；流動(dòng)相為甲醇-水30∶70）和10（2.5 mg；流動(dòng)相為甲醇-水30∶70）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H- 和13C-NMR數(shù)據(jù)(500/125 MHz, CDCl3)

Table 1 1H- and 13C-NMR data of compound 1 (500/125 MHz, CDCl3)

碳位δHδC 2 155.1 43.46 (m)50.0 51.95 (m), 1.81 (m)31.1 61.78 (m), 1.23 (m)26.4 71.51 (m)25.6 81.23 (m)25.5 91.09 (m), 0.86 (m)24.7 101.09 (m), 0.86 (m)24.7 111.23 (m)25.5 121.51 (m)25.6 131.78 (m), 1.23 (m)26.4 141.95 (m), 1.81 (m)32.5 154.16 (m)57.4 1′ 171.3 2′ 128.7 3′,7′7.45 (d, J = 8.5 Hz)129.5 4′,6′6.77 (d, J = 8.5 Hz)115.6 5′ 159.1

圖1 化合物1結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵HMBC ()、1H-1H COSY () 相關(guān)

化合物4：黃色粉末，mp 250～252 ℃，HR-ESI-MS/: 434.180 7 [M＋H]+（計(jì)算值為434.182 3），分子式為C23H23N5O4。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 3.66 (3H, s, 1-OCH3), 7.54 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4), 7.04 (1H, t,= 7.5 Hz, H-5), 7.26 (1H, t,= 7.5 Hz, H-6), 6.98 (1H, d,= 8.0 Hz, H-7), 5.25 (1H, s, H-8), 9.26 (1H, s, 9-OH), 10.13 (1H, s, 14-NH), 8.19 (1H, s, H-15), 7.77 (1H, s, H-18), 12.91 (1H, s, 19-NH), 7.36 (1H, s, H-20), 6.00 (1H, s, H-22), 4.98 (2H, m, H-23), 1.20 (6H, s, H-24, H-25)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 64.8 (1-OCH3), 101.3 (C-2), 52.2 (C-3), 125.6 (C-3a), 124.7 (C-4), 123.2 (C-5), 127.9 (C-6), 111.5 (C-7), 146.3 (C-7a), 109.1 (C-8), 142.9 (C-9), 158.5 (C-10), 123.7 (C-12), 164.9 (C-13), 106.8 (C-15), 126.0 (C-16), 137.7 (C-18), 134.2 (C-20), 41.8 (C-21), 143.4 (C-22), 112.9 (C-23), 24.3 (C-24), 23.2 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物4為meleagrin。

化合物5：黃色粉末，mp 319～321 ℃，HR-ESI-MS/: 257.044 4 [M－H]?（計(jì)算值為 257.045 5），分子式為C14H10O5。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 6.67 (1H, brs, H-5′), 6.31 (1H, brs, H-4), 6.59 (1H, brs, H-3′), 7.20 (1H, brs, H-6), 2.65 (3H, brs, H-7′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 138.3 (C-1), 97.4 (C-2), 164.7 (C-3), 100.9 (C-4), 164.1 (C-5), 104.3 (C-6), 165.5 (C-7), 109.0 (C-1′), 138.1 (C-2′), 101.6 (C-3′), 158.4 (C-4′), 117.5 (C-5′), 152.6 (C-6′), 25.3 (C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物5為alternariol。

化合物6：黃色粉末，mp 275～277 ℃，HR-ESI-MS/: 271.062 2 [M－H]?（計(jì)算值為271.061 2），分子式為C15H12O5。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 6.73 (1H, brs, H-5′), 6.66 (1H, brs, H-3′), 6.61 (1H, brs, H-4), 7.21 (1H, brs, H-6), 2.73 (3H, s, H-7′), 3.90 (3H, s, 5-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 138.4 (C-1), 98.5 (C-2), 164.0 (C-3), 99.2 (C-4), 164.7 (C-5), 103.4 (C-6), 166.2 (C-7), 109.5 (C-1′), 137.8 (C-2′), 101.6 (C-3′), 158.7 (C-4′), 117.6 (C-5′), 152.6 (C-6′), 25.0 (C-7′), 55.8 (5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定化合物6為alternariol methyl ether。

化合物11：白色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 171～173 ℃，EI-MS/: 428 [M]+，分子式為C28H44O3。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 3.93 (1H, m, H-3), 6.21 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6), 6.45 (1H, d,= 8.5 Hz, H-7), 0.85 (3H, s, H-18), 1.20 (3H, s, H-19), 0.96 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21), 5.11 (1H, dd,= 8.5, 15.5 Hz, H-22), 5.19 (1H, dd,= 8.5, 15.5 Hz, H-23), 0.79 (3H, d,= 5.0 Hz, H-26), 0.77 (3H, d,= 5.0 Hz, H-27), 0.87 (3H, d,= 7.0 Hz, H-28)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 34.9 (C-1), 30.3 (C-2), 66.7 (C-3), 37.1 (C-4), 82.4 (C-5), 135.6 (C-6), 130.9 (C-7), 79.6 (C-8), 51.2 (C-9), 37.0 (C-10), 23.6 (C-11), 39.5 (C-12), 44.7 (C-13), 51.9 (C-14), 20.2 (C-15), 28.9 (C-16), 56.4 (C-17), 13.1 (C-18), 18.4 (C-19), 39.5 (C-20), 20.8 (C-21), 135.4 (C-22), 132.5 (C-23), 43.0 (C-24), 33.3 (C-25), 19.9 (C-26), 18.4 (C-27), 17.8 (C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[26]，故鑒定化合物11為過氧化麥角甾醇。

化合物12：白色結(jié)晶（甲醇），mp 137～139 ℃，EI-MS/: 414 [M]+，分子式為C29H50O。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 3.50 (1H, m, H-3), 5.32 (1H, d,=.0 Hz, H-6), 0.65 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21), 0.83 (3H, d,= 4.5 Hz, H-26), 0.78 (3H, s, H-27), 0.85 (3H, d,= 2.0 Hz, H-29)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 37.5 (C-1), 31.9 (C-2), 72.0 (C-3), 42.5 (C-4), 141.0 (C-5), 121.9 (C-6), 32.1 (C-7), 32.1 (C-8), 50.3 (C-9), 36.7 (C-10), 21.3 (C-11), 40.0 (C-12), 42.5 (C-13), 57.0 (C-14), 24.5 (C-15), 28.5 (C-16), 56.2 (C-17), 12.2 (C-18), 19.6 (C-19), 36.4 (C-20), 19.0 (C-21), 34.1 (C-22), 26.2 (C-23), 46.0 (C-24), 29.3 (C-25), 19.2 (C-26), 20.1 (C-27), 23.3 (C-28), 12.1 (C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[27]，故鑒定化合物12為β-谷甾醇。

化合物15：白色粉末，mp 184～186 ℃，HR-ESI-MS/: 139.042 0 [M－H]?（計(jì)算值為139.040 1），分子式為C7H8O3。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 5.93 (1H, s, H-5), 1.82 (3H, s, H-7), 2.16 (3H, H-8)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 169.7 (C-2), 98.3 (C-3), 161.1 (C-4), 103.2 (C-5), 160.5 (C-6), 8.5 (C-7), 19.6(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[30]，故鑒定化合物15為4-hydroxy-3,6- dimethyl-2-pyran-2-one。

化合物16：淺黃色粉末，mp 214～216 ℃，HR-ESI-MS/: 137.024 9 [M－H]?（計(jì)算值為137.024 4），分子式為C7H6O3。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.83 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2, 6), 6.77 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 122.9 (C-1), 133.1 (C-2, 6), 116.2 (C-3, 5), 163.5 (C-4), 172.8 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[31]，故鑒定化合物16為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物17：白色粉末，mp 106～108 ℃，HR-ESI-MS/: 121.028 2 [M－H]?（計(jì)算值為121.029 5），分子式為C7H6O2。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.75 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.89 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5), 9.74 (1H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 128.6 (C-1), 132.0 (C-2, 6), 115.5 (C-3, 5), 163.7 (C-4), 191.4 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[32]，故鑒定化合物17為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物18：白色粉末，mp 200～202 ℃，HR-ESI-MS/: 167.035 8 [M－H]?（計(jì)算值為 167.035 0），分子式為C8H8O4。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.53 (1H, s, H-2), 6.80 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.51 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 3.87 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 123.2 (C-1), 115.8 (C-2), 148.7 (C-3), 152.4 (C-4), 113.8 (C-5), 125.1 (C-6), 169.4 (C-7), 56.5 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[33]，故鑒定化合物18為香草酸。

化合物19：無(wú)色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 148～150 ℃，HR-ESI-MS/: 151.041 4 [M－H]?（計(jì)算值為 151.040 1），分子式為C8H8O3。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.83 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2, 6), 6.77 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3, 5), 3.31 (2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 126.9 (C-1), 131.5 (C-2, 6), 116.3 (C-3, 5), 157.4 (C-4), 41.2 (C-7), 176.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[34]，故鑒定化合物19為對(duì)羥基苯乙酸。

化合物20：白色片狀晶體（甲醇），mp 89～91 ℃，EI-MS/: 138 [M]+，分子式為C8H10O2。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 3.68 (2H, t,= 7.5 Hz, H-1), 2.71 (2H, t,= 7.5 Hz, H-2), 7.02 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2′, 6′), 6.69 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3′, 5′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 63.2 (C-1), 38.0 (C-2), 129.4 (C-1′), 129.6 (C-2′, 6′), 114.7 (C-3′, 5′), 155.3 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[35]，故鑒定化合物20為酪醇。

4 活性篩選

參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[36]測(cè)定乙酰膽堿酯酶抑制活性，抗血小板釋放ATP作用方法[16]如下：設(shè)對(duì)照組、模型組和給藥組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組分別加入100 μL血小板懸液，放入CO2培養(yǎng)箱孵育5 min。給藥組加入25 μL不同濃度（0、4、20、100 μmol/L）的化合物，對(duì)照組和模型組加入等體積的HBSS緩沖液。隨后在給藥組和模型組加入25 μL凝血酶至終濃度0.05 U/mL，對(duì)照組加入等體積的HBSS緩沖液。在各孔加入50 μL熒光素酶底物，室溫反應(yīng)5 min，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定生物發(fā)光值（RLU），按照公式計(jì)算各化合物對(duì)血小板釋放ATP的抑制率和半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）值。

抑制率＝(RLU模型組均值－RLU給藥組均值)/(RLU模型組均值－RLU對(duì)照組均值)

結(jié)果表明化合物5在100 μmol/L時(shí)有一定的抗血小板釋放ATP作用，其抑制率為（40.6±5.2）%。陽(yáng)性藥LY294002抑制率為（102.7±3.1）%；化合物1抑制率為（32.9±9.6）%，其他化合物抑制率均小于20%；所有化合物在100 μmol/L時(shí)對(duì)乙酰膽堿酯酶不顯示抑制活性，所有化合物的抑制率均小于10%，陽(yáng)性藥石杉?jí)A甲IC50為（0.54±0.02）μmol/L。

5 討論

本研究對(duì)蛇足石杉內(nèi)生真菌MT-40的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，得到20個(gè)化合物，包括生物堿類化合物、聚酮類化合物、甾體類化合物和小分子芳香類化合物，其中化合物1為新化合物。新化合物1的結(jié)構(gòu)中含有獨(dú)特的二氫噁唑并十二元大環(huán)結(jié)構(gòu)，這類結(jié)構(gòu)在文獻(xiàn)報(bào)道的天然產(chǎn)物中非常少見，根據(jù)其結(jié)構(gòu)推測(cè)可能是在聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）、非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）、酰基轉(zhuǎn)移酶的共同作用下生成，但其確切的合成機(jī)制尚在研究中。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolites fromMT-40, an endophytic fungus isolated from

JIA Fang-fang1, 2, QI Bo-wen1, ZHANG Bei-bei1, WANG Wen-jing1, WANG Yang1, SHI Fan-yu1, LIU Xiao1, ZHU Zhi-xiang1, WANG Juan1, SHI She-po1

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Gaoping Chinese Medicine Hospital, Gaoping 048400, China

To investigate the chemical metabolites fromMT-40, an endophytic fungus isolated from.The compounds were isolated and purified by using various column chromatographies including silica gel, Sephadex LH-20, and-preparative HPLC. The structures were established using extensive spectroscopic techniques such as IR, MS, and NMR. The inhibitory activities against ATP release of platelets and acetylcholinesterase of all the isolates were also investigated by usingmodels.Twenty compounds including (±)--(3a,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,13a- dodecahydrocyclododeca []oxazol-2-yl)-4-hydroxybenzamide (1), cyclo-(Trp-Tyr) (2), cyclo-(Trp-Phe) (3), meleagrin (4), alternariol (5), alternariol methyl ether (6), altenuene (7), koninginin B (8), koninginin F (9), koninginin D (10), ergosterol peroxide (11), βsitosterol (12), volemolide (13), 4-hydroxy-17-methylincisterol (14), 4-hydroxy-3,6-dimethyl-2-pyran-2-one (15),-hydroxybenzoic acid (16), 4-hydroxybenzaldehyde (17), 4-hydroxy-3- methoxybenzoic acid (18), 4-hydroxyphenylacetic acid (19), and tyrosol (20) were isolated from the solid fermentation cultures ofMT-40.Compound 1 is a new compound; Compound 5 exhibited slight inhibitory activities on ATP release of thrombin-activated platelets with inhibition rate of (40.6 ±5.2)% at the concentration of 100 μmol/L. All the compounds didn′t exhibit inhibitory activities on AChE at the concentration of 100 μmol/L.

(Thunb. ex Murray) Trev.; endophytic fungi;; alkaloids; polyketides; (±)-penicialkaloid A; alternariol

R284.1

A

0253 - 2670(2022)13 - 3904 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.003

2021-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81773842）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81903495）；北京中醫(yī)藥大學(xué)新教師啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2021-JYB-XJSJJ-005）

賈放放，女，主要從事中藥化學(xué)成分研究。E-mail: jiaff017@163.com

史社坡，研究員，主要從事中藥活性成分發(fā)現(xiàn)及合成生物學(xué)研究。E-mail: shishepo@163.com

王 娟，講師，主要從事中藥活性成分發(fā)現(xiàn)及合成生物學(xué)研究。E-mail: wjwangjuan2012@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]