臺州地區(qū)1 376例育齡女性MTHFR基因多態(tài)性分析

許美芬，梁玲芝，徐友文

(臺州市中心醫(yī)院(臺州學(xué)院附屬醫(yī)院)醫(yī)學(xué)檢驗科，浙江 臺州 318000)

中國是出生缺陷高發(fā)國家，WHO估計我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬例。有研究表明，育齡女性體內(nèi)葉酸缺乏是引起胎兒出生缺陷的主要因素，而葉酸攝入不足和由遺傳因素引起的葉酸利用率障礙是體內(nèi)葉酸缺乏的主要原因。MTHFR是葉酸的代謝關(guān)鍵酶，最常見的兩種突變位點為C677T 和A1298C。相關(guān)文獻報道指出，基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病、神經(jīng)管缺陷和新生兒自閉癥等疾病有關(guān)，而基因多態(tài)性存在種族及地域的差異性。本研究調(diào)查臺州地區(qū)育齡女性基因C677T和A1298C位點基因型分布，并與國內(nèi)其他地區(qū)進行比較，進而闡明本地區(qū)女性基因的遺傳特征，以期能幫助臨床醫(yī)生針對性制定個體化葉酸補充方案，從而有效預(yù)防和降低出生缺陷的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年4月—2019年4月在臺州市中心醫(yī)院(臺州學(xué)院附屬醫(yī)院)進行孕前或孕期檢查的女性1 376名，平均年齡(29.39±4.84)歲。本研究經(jīng)臺州市中心醫(yī)院(臺州學(xué)院附屬醫(yī)院)倫理委員會批準(zhǔn)，且研究對象簽署知情同意書。

1.2 檢測 采集研究對象靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝。按照血液基因組DNA提取試劑盒(蘇州天隆生物技術(shù)有限公司)的說明書提取研究對象的基因組DNA，采用熒光定量PCR法檢測C677T和A1298C基因多態(tài)性。PCR 擴增程序為 95 ℃總變性 10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，40個循環(huán)后 60 ℃采集熒光。根據(jù)葉酸代謝能力測定試劑盒(江西諾德醫(yī)療器械有限公司)說明書及熒光采集量判斷基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用HaploView 4.2軟件進行SNPs的Hardy-Weinberg 平衡，LD水平和單倍型結(jié)構(gòu)分析。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率(%)表示，對基因型及等位基因頻率進行檢驗，<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡分析結(jié)果基因C677T位點基因型有野生型CC、雜合型CT和突變型TT；基因A1298C位點基因型有野生型AA、雜合型AC和突變型CC。本研究對象基因C677T和A1298C兩個位點的基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(>0.05)，表明本研究對象具有該區(qū)域的群體代表性。

2.2 基因型分布特征 本研究中1 376名女性的基因C677T位點以雜合型CT為主，A1298C位點以野生型AA為主。將兩位點的基因型分布特征與相關(guān)文獻報道的數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)果顯示：臺州地區(qū)女性基因C677T位點的基因型分布特征與瓊海、南寧、武漢、烏魯木齊、遼源、煙臺、廊坊和新鄉(xiāng)比較，基因A1298C位點的基因型分布特征與瓊海、南寧、長沙、遼源、煙臺、廊坊和新鄉(xiāng)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。見表1。

表1 不同地區(qū)女性MTHFR 基因C677T和A1298C位點基因型分布特征[n(%)]

2.3 等位基因分布特征 將本研究中基因C677T和A1298C位點的等位基因分布特征與相關(guān)文獻報道的數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)果顯示：臺州地區(qū)女性基因C677T位點等位基因C、T和A1298C位點等位基因A、C分布情況與湘潭、昆明比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)；與瓊海、南寧、遼源、煙臺、廊坊和新鄉(xiāng)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。見表2。

表2 不同地區(qū)女性MTHFR 基因C677T和A1298C位點等位基因分布特征[n(%)]

2.4C677T 和 A1298C位點連鎖情況及單倍型分析結(jié)果 本研究中最常見的組合是CT/AA(31.5%，433/1 376)，其次是CC/AC(19.0%，261/1 376)、CC/AA(17.9%，246/1 376)、TT/AA(14.4%，199/1 376)、CT/AC(12.4%，171/1 376)，CC/CC(4.8%，66/1 376)，未檢測到TT/AC、TT/CC和CT/CC這3種組合。HaploView 4.2 軟件分析結(jié)果顯示：臺州地區(qū)女性C677T和A1298C兩位點構(gòu)建的單倍型有3種組合，即677C/1298A(43.1%)、677T/1298A(36.4%)、677C/1298C(20.5%)，兩位點間存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象(D’=1.0)。

2.5基因C677T和A1298C兩位點基因型代謝型分布 臺州地區(qū)1 376名育齡女性基因代謝型以較弱代謝型為主，正常代謝型為36.85%。見表3。

表3 臺州地區(qū)1 376名育齡女性MTHFR 基因C677T和A1298C兩位點基因型代謝型分布

3 討論

的主要生理功能是催化5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-MTHF)轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)，后者是體內(nèi)重要的甲基供體，在同型半胱氨酸復(fù)甲基化生成蛋氨酸的過程中參與同型半胱氨酸的代謝?；蜃畛Ｒ姷膬煞N突變位點為C677T 和A1298C，C677T 突變是一種常見的不耐熱錯義突變，該位點發(fā)生突變將導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性下降，以致酶活性降低。與野生型相比，純合突變和雜合突變后酶活性分別為原來的32%和64%。A1298C這一突變位點位于酶的S-腺苷蛋氨酸調(diào)節(jié)域，其與的結(jié)合可通過構(gòu)象的轉(zhuǎn)變抑制酶的活性，同樣使酶活性下降。有研究表明，當(dāng)以上兩個位點同時發(fā)生雜合突變時，即677CT/1298AC 基因型，其的酶活性僅為野生型的36%，這將造成葉酸代謝障礙，大大增加了新生兒神經(jīng)管缺陷、唐氏綜合征及唇腭裂等疾病的發(fā)病風(fēng)險，對于這類人群則需要補充更大劑量的葉酸才能達到預(yù)期的效果。

目前，尚未有臺州地區(qū)大樣本育齡女性葉酸代謝基因的報道，本研究對臺州地區(qū)育齡女性基因C677T和A1298C位點基因型分布進行調(diào)查分析，結(jié)果顯示：C677T位點的CC、CT和TT基因型頻率分別為41.6%、43.9%和14.5%，A1298C基因位點的AA、AC和CC基因型頻率分別為63.8%、31.4%和4.8%，C677T位點的等位基因C、T的頻率分別為63.6%、36.4%，A1298C位點的等位基因A、C的頻率分別為79.5%、20.5%。進一步與其他已報道地區(qū)的數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)果顯示：C677T和A1298C位點的基因型頻率和等位基因頻率與已報道的遼源、廊坊、煙臺、南寧、瓊海和新鄉(xiāng)等地差異顯著。分析發(fā)現(xiàn)，本研究中C677T位點的TT型頻率為14.5%，符合南方城市(瓊海6.2%、南寧7.7%、湘潭12.6%)TT型頻率低于北方城市(烏魯木齊24.1%、煙臺32.2%、廊坊33.9%)的分布特點，這也與我國神經(jīng)管出生缺陷發(fā)病率呈現(xiàn)“南低北高”的現(xiàn)象相符，究其原因可能與研究對象的種族、地區(qū)和遺傳背景等不同密切相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，臺州地區(qū)育齡女性C677T和A1298C兩位點最常見的組合是 CT/AA(31.5%)，未檢測到TT/AC、TT/CC和CT/CC這3種組合；C677T 和 A1298C兩位點存在單倍型連鎖不平衡，這與陳徐等的報道相一致。本研究中，育齡女性的基因代謝型正常代謝型才占36.85%，這意味著超過60%的育齡女性存在葉酸代謝障礙的風(fēng)險，對存在突變基因型而引起葉酸代謝能力障礙的女性而言，補充0.4 mg常規(guī)劑量的葉酸并不能達到預(yù)期的效果，需要更多的葉酸量才能減少孕期疾病的發(fā)生，降低新生兒缺陷的發(fā)生率。

綜上所述，臺州地區(qū)育齡女性C677T和A1298C兩位點的基因型及等位基因分布具有區(qū)域特異性。因此，通過開展葉酸代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性的大樣本分子流行病學(xué)調(diào)查，篩選出葉酸代謝障礙的育齡女性，根據(jù)其基因型為育齡婦女制定個體化的葉酸補充方案，為指導(dǎo)本地區(qū)育齡女性合理選擇葉酸劑量提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。