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    羊棲菜褐藻糖膠寡糖組分分析及抗凝血活性

    2022-07-07 03:05:10任晨瑜張綿松白新峰王令書(shū)崔婷婷史亞萍劉昌衡賈愛(ài)榮
    食品科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:褐藻抗凝血寡糖

    劉 雪,任晨瑜,2,劉 新,張綿松,白新峰,王令書(shū),崔婷婷,史亞萍,劉昌衡,賈愛(ài)榮,*

    (1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省科學(xué)院生物研究所,山東 濟(jì)南 250103;2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353;3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊 261053)

    多糖是近年來(lái)研究較多的一種活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖降血脂等生物活性。但是,多糖作用靶點(diǎn)不明確、分子質(zhì)量大、黏度高、生物利用度低,極大限制了其在醫(yī)藥上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。近年來(lái),寡糖的相關(guān)研究逐漸增多,與多糖相比,寡糖結(jié)構(gòu)清晰、水溶性高、生物利用度好,部分寡糖顯示出與母糖相似或高于母糖的生物活性。因此,寡糖的開(kāi)發(fā)研究對(duì)糖類化合物的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

    褐藻糖膠又名巖藻聚糖硫酸酯,是一種硫酸化多糖,廣泛存在于褐藻和海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中。褐藻糖膠具有明顯的抗凝血活性,Mansour等從海參中分離出高分子質(zhì)量,高硫酸基含量的褐藻糖膠,這種褐藻糖膠表現(xiàn)出主要由肝素輔因子II介導(dǎo)的強(qiáng)抗凝血活性。Wang Jing等從海帶中得到了3種低分子質(zhì)量褐藻糖膠,這3種多糖均能顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間,具有較好的抗凝血活性。Li Bo等研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯能夠顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間,具有良好的抗凝血活性。羊棲菜()是一種常見(jiàn)的褐藻,隸屬于褐藻門(mén)墨角藻目馬尾藻科,具有較高的食用和藥用價(jià)值,廣泛分布于我國(guó)的淺海水域,韓國(guó)、日本也有分布。褐藻糖膠是羊棲菜中重要的活性成分,但是,羊棲菜褐藻糖膠也存在分子質(zhì)量大、黏度高等特點(diǎn),限制了它的開(kāi)發(fā)利用。寡糖的研究有利于推進(jìn)褐藻糖膠進(jìn)一步的發(fā)展。

    本實(shí)驗(yàn)從羊棲菜中分離純化得到一種褐藻糖膠,采用酸降解法降解得到5種寡糖組分,通過(guò)測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)評(píng)價(jià)其抗凝血活性。篩選高抗凝血低分子質(zhì)量寡糖組分,對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜解析,探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羊棲菜取自于2018年5月采自浙江省平陽(yáng)縣南麂島國(guó)家海洋自然保護(hù)區(qū)。

    葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Flu-ka公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白和低分子質(zhì)量肝素鈉 美國(guó)Sigma公司;乙腈(色譜純) 美國(guó)Tedia公司;APTT、TT、PT測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;DEAE-Sepharose Fast Flow 美國(guó)GE healthcare公司;Bio-gel P4(Fine,45 μm) 美國(guó)Bio-Rad公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Elipse XDB-C(4.6 mm×250 mm,5 μm)、1260高效液相色譜儀、LCMS6460質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司;ohpak SB-804HQ高效凝膠滲透色譜柱日本Shodex公司;Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;SL-318半自動(dòng)血凝儀 濟(jì)南森藍(lán)公司。

    1.3 方法

    1.3.1 褐藻糖膠提取和分離純化

    羊棲菜褐藻糖膠的提取參照Silchenko等的方法且略作修改。將羊棲菜洗凈烘干,粉碎成末。取適量藻體粉末,加入95%乙醇脫脂,料液比為1∶30(g/mL),室溫下攪拌24 h。取適量脫脂后的藻體粉末,加入2% CaCl溶液,料液比為1∶30(g/mL),60 ℃攪拌3 h,靜置,冷卻到室溫,離心,收集上層清液。將上層清液超濾濃縮,截留分子質(zhì)量為100 kDa。濃縮后的提取液加入4 倍體積95%乙醇溶液,醇沉,4 ℃靜置過(guò)夜12 h,離心,收集沉淀部分。沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇脫水后,置于40 ℃烘箱中干燥,得到羊棲菜多糖粗品。采用DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱(4.0 cm×30 cm)對(duì)羊棲菜多糖進(jìn)行分離純化,0、0.5、1、2、3 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,收集2 mol/L洗脫組分,除鹽、濃縮凍干,命名為SFF。

    1.3.2 HPGPC法測(cè)定分子質(zhì)量

    將不同分子質(zhì)量系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)SFF配制成5 mg/mL的溶液,在下述條件下測(cè)定分子質(zhì)量。分析柱:Shodex ohpak SB-804HQ(7.6 mm×300 mm),示差折光檢測(cè)器在線檢測(cè),流動(dòng)相0.1 mol/L NaSO溶液,流速0.5 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量20 μL。繪制以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),保留時(shí)間為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

    1.3.3 單糖組成

    采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定SFF的單糖組成。準(zhǔn)確稱取2 mg樣品,加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液,110 ℃條件下降解6 h,得到完全酸水解的單糖樣品。對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品及完全酸水解的單糖樣品進(jìn)行PMP衍生,首先將其溶于100 μL蒸餾水,加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液及120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液,置于70 ℃水浴中反應(yīng)100 min。反應(yīng)完畢后中和,用二氯甲烷萃取3 次,除去未反應(yīng)的PMP,上層液體過(guò)0.22 μm的微孔濾膜后進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件:C色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫35 ℃,流動(dòng)相為磷酸緩沖溶液-乙腈(83∶17,/),流速1.0 mL/min,紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

    1.3.4 理化性質(zhì)

    總糖含量:采用硫酸-苯酚法測(cè)定,蛋白含量:采用Folin-酚法測(cè)定;硫酸基含量:采用氯化鋇明膠比濁法測(cè)定;糖醛酸含量:采用咔唑-硫酸法測(cè)定。

    1.3.5 寡糖的制備

    將多糖以0.1 mol/L HCl溶液配制成10 mg/mL,于80 ℃水浴10 h,反應(yīng)液降至室溫后,調(diào)節(jié)pH值至中性。透析(截留分子質(zhì)量為100 Da),濃縮凍干,樣品備用。

    1.3.6 寡糖的分離純化

    降解產(chǎn)物采用Bio-Gel P4色譜柱進(jìn)行分離純化。以0.2 mol/L NHHCO溶液為流動(dòng)相,0.1 mL/min洗脫,洗脫后采用硫酸-苯酚法檢測(cè),收集峰尖部分,除氨凍干。

    1.3.7 寡糖的質(zhì)譜分析

    采用負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜對(duì)寡糖進(jìn)行分析。取少量寡糖組分,以乙腈-水(1∶1,/)溶液溶解,使其濃度達(dá)到5~10 pmol/L,注射5 μL進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析中,以氮?dú)庾鳛槿軇┑拇蹈蓺怏w和噴霧氣體,流速分別為250 L/h和15 L/h;流動(dòng)相為乙腈-水(1∶1,/),在泵的動(dòng)力下,從注射器以10 μL/min的流速注入;毛細(xì)管電壓為3 kV,錐孔電壓為50 eV,離子源和溶劑揮發(fā)溫度分別為80 ℃和150 ℃。

    1.3.8 核磁共振波譜分析

    稱取10 mg寡糖樣品,用重水溶解后凍干,反復(fù)3 次。得到的樣品溶于0.5 mL重水中,加入少量?jī)?nèi)標(biāo)氘代丙酮,采用Bruker Avance III HD 400 MHz核磁共振波譜儀測(cè)定核磁圖譜。

    1.3.9 抗凝血活性測(cè)定

    將SFF配制成0.5、1.0、2.5 mg/mL,與血漿以1∶9的體積比混合。APTT、TT、PT的測(cè)定按照試劑盒要求進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 褐藻糖膠的分離純化、分子質(zhì)量和理化性質(zhì)分析

    從羊棲菜中提取得到褐藻糖膠粗品,經(jīng)DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化,得到3個(gè)明顯的洗脫峰(圖1),收集含量最高的2 mol/L NaCl溶液洗脫組分為SFF。測(cè)定褐藻糖膠SFF的分子質(zhì)量和理化性質(zhì)如表1所示。SFF的分子質(zhì)量較高,為708 kDa;總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.44%;蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低,為1.14%;硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.22%,不含糖醛酸。SFF的分子質(zhì)量和理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果與前期報(bào)道的結(jié)果相似。

    圖1 褐藻糖膠SFF的分離純化圖Fig. 1 Chromatogram for separation and purification of SFF

    表1 褐藻糖膠SFF的理化性質(zhì)分析Table 1 Physicochemical properties of SFF

    2.2 褐藻糖膠的單糖組成分析

    如圖2所示,通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可知,SFF由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖4種糖基組成,物質(zhì)的量比為67.11∶26.69∶2.54∶3.66,其中巖藻糖和半乳糖為主要組成成分。SFF含有大量的硫酸基團(tuán)和巖藻糖,進(jìn)一步表明SFF是褐藻糖膠的一種。

    圖2 褐藻糖膠SFF的單糖組成分析Fig. 2 Monosaccharide composition of SFF

    2.3 寡糖的分離純化

    將多糖降解產(chǎn)物配制成10 mg/mL,經(jīng)Bio-Gel P4色譜柱分離純化,洗脫液以硫酸-苯酚法檢測(cè)糖含量,繪制洗脫曲線,如圖3所示。多糖降解產(chǎn)物分離后,得到5種寡糖組分,根據(jù)分子質(zhì)量大小,命名為P1~P5,其中P1分子質(zhì)量最大。

    圖3 褐藻糖膠SFF降解產(chǎn)物的Bio-Gel P4譜圖Fig. 3 Gel permeation chromatogram of oligosaccharides on Bio-Gel P4

    2.4 寡糖的抗凝血活性

    在凝血機(jī)制中,APTT反映了內(nèi)源性或者共同凝血途徑,TT反映了對(duì)凝血酶活性或者纖維蛋白的作用,PT反映了外源性凝血途徑。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定5種寡糖組分對(duì)APTT、TT、PT的延長(zhǎng)作用,以評(píng)價(jià)寡糖的抗凝血活性。如表2所示,5種寡糖組分均可延長(zhǎng)APTT,其中寡糖組分P1、P2、P3對(duì)APTT的延長(zhǎng)作用高于P4、P5,P3的延長(zhǎng)作用尤其明顯。對(duì)TT和PT無(wú)延長(zhǎng)作用,說(shuō)明羊棲菜褐藻糖膠寡糖組分對(duì)內(nèi)源性或者共同凝血途徑有抑制作用,對(duì)凝血酶活性、纖維蛋白的聚合以及外源性凝血途徑的作用不大。與肝素相比,寡糖組分對(duì)APTT的延長(zhǎng)作用偏低,但是較為溫和,隨著濃度的增加,延長(zhǎng)作用逐漸增加,而肝素在50 μg/mL時(shí),APTT已達(dá)到200 s。此外,肝素對(duì)PT和TT均具有顯著的延長(zhǎng)作用,而寡糖組分對(duì)PT和TT的延長(zhǎng)作用不明顯,說(shuō)明羊棲菜褐藻膠寡糖與肝素的抗凝機(jī)制不完全相同。目前,有關(guān)褐藻糖膠/褐藻糖膠寡糖的抗凝血活性研究較少,抗凝血寡糖的結(jié)構(gòu)研究更為少見(jiàn)。趙雪等采用自由基氧化降解法制備了不同分子質(zhì)量和硫酸基含量的褐藻糖膠,測(cè)定了抗凝血活性,揭示了褐藻糖膠中影響抗凝血活性的主要因素,但是,對(duì)高抗凝血活性褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)并無(wú)說(shuō)明,且分子質(zhì)量降低后活性明顯降低。Wang Jing等從海帶中分離得到的3種低分子質(zhì)量褐藻糖膠,均能顯著延長(zhǎng)活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間,具有較好的抗凝血活性,但是分子質(zhì)量仍較大,為4~8 kDa。

    表2 褐藻糖膠SFF寡糖組分的抗凝血活性Table 2 Anticoagulant activity of oligosaccharides derived from SFF

    2.5 寡糖組分P3的質(zhì)譜及核磁共振波譜分析

    寡糖組分P3是具有高抗凝血活性同時(shí)分子質(zhì)量最小的組分,因此,采用質(zhì)譜法對(duì)P3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜(圖4)顯示P3主要存在雙電荷離子峰/307,表明P3主要由分子質(zhì)量為616 Da的寡糖片段組成,推斷其為二硫酸化巖藻三糖[Fuc(SO)]。二級(jí)質(zhì)譜給出了/307(圖5)的斷裂片段,但是信息相對(duì)較少。因此,對(duì)寡糖組分P5、P4中的寡糖片段進(jìn)行質(zhì)譜分析,進(jìn)而推斷出二硫酸化巖藻三糖的結(jié)構(gòu)。

    圖4 寡糖組分P3的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 4Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P3

    圖5 寡糖片段m/z 307二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 5 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 307

    圖6 是寡糖組分P5的一級(jí)質(zhì)譜,離子/243推斷為硫酸化巖藻單糖,是其主要的寡糖片段。二級(jí)質(zhì)譜(圖7)顯示了離子/243斷裂片段信息,碎片離子/139推斷為X斷裂,而X斷裂是C-2硫酸化的主要斷裂方式,推斷硫酸基團(tuán)可能位于C-2位。高豐度碎片離子/97的出現(xiàn)表明硫酸基團(tuán)也可能位于C-3位。因此,硫酸基團(tuán)可能位于巖藻糖的C-2或C-3位。

    圖6 寡糖組分P5的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 6 Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P5

    圖7 寡糖片段m/z 243二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 7 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 243

    圖8 是寡糖組分P4的一級(jí)質(zhì)譜,離子/389推斷為硫酸化巖藻二糖,是其主要的寡糖片段之一。二級(jí)質(zhì)譜(圖9)顯示了離子/389的碎片離子信息,/329的出現(xiàn)表明二糖間的連接方式為1→4連接,且還原端巖藻糖C-3位上無(wú)硫酸基團(tuán)。未出現(xiàn)碎片離子/139表明還原端巖藻糖的C-2位上無(wú)硫酸基團(tuán),因此硫酸基團(tuán)位于非還原端的C-2或C-3位。綜上所述,硫酸化巖藻二糖可能存在以下異構(gòu)體:--Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc和-Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc。

    圖8 寡糖組分P4的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 8 Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P4

    圖9 寡糖片段m/z 389二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 9 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 389

    根據(jù)上述分析結(jié)果可知,SFF寡糖組分的硫酸基團(tuán)位于巖藻糖基的C-2和C-3位,巖藻糖基之間的連接方式為1,4-連接。推斷離子/307為二硫酸化巖藻三糖,因此,它的結(jié)構(gòu)可能是在硫酸化巖藻二糖的基礎(chǔ)上增加硫酸基團(tuán)及巖藻糖殘基。在離子/307的二級(jí)質(zhì)譜中,碎片離子/139的出現(xiàn)表明存在還原端C-2位硫酸基團(tuán),相對(duì)高豐度碎片離子/97的出現(xiàn)表明硫酸基團(tuán)也可能位于巖藻糖殘基的C-3位,這與前述分析結(jié)果一致。此外,碎片離子/234推斷為二硫酸化巖藻二糖,表明兩個(gè)硫酸基團(tuán)相鄰。因此,離子/307可能存在以下異構(gòu)體,如圖10所示,--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc(2SO),--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc(2SO),--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc(3SO),--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc(3SO)。二硫酸化巖藻三糖中硫酸基團(tuán)的位置還可通過(guò)核磁共振氫譜進(jìn)一步確定。如圖11所示,低場(chǎng)區(qū)5.00~5.50為--Fuc異頭氫所在的區(qū)域,主要有3個(gè)異頭氫信號(hào)5.16、5.26及5.42,1.25是巖藻糖C-6位甲基上的氫信號(hào)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,5.42處為2-硫酸化-巖藻糖殘基,5.26處為3-硫酸化-巖藻糖殘基。其中,5.26處的異頭氫信號(hào)強(qiáng)度最高,說(shuō)明二硫酸化巖藻三糖的硫酸基團(tuán)主要位于C-3位。這與質(zhì)譜分析結(jié)果一致,進(jìn)一步說(shuō)明了二硫酸化巖藻三糖的硫酸基團(tuán)位于C-2和C-3位,C-3位是主要的硫酸化位點(diǎn)。

    硫酸化多糖的生物活性與多種因素有關(guān),如分子質(zhì)量、硫酸基團(tuán)含量等。Liu Xue等從綠藻中提取得到硫酸化鼠李聚糖,發(fā)現(xiàn)其抗凝血活性隨著分子質(zhì)量的減小逐漸降低。Mazumder等從紅藻中提取得到硫酸化半乳聚糖,其抗病毒活性與分子質(zhì)量密切相關(guān),分子質(zhì)量越高,對(duì)單純皰疹病毒I和II的選擇性抗病毒活性越明顯。硫酸基團(tuán)含量也是影響多糖生物活性的重要因素,Koyanagi等研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠和過(guò)硫酸化褐藻糖膠均可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的有絲分裂和趨化性,但是過(guò)硫酸化褐藻糖膠的抑制作用更加明顯。本實(shí)驗(yàn)中,寡糖組分P3主要是二硫酸化巖藻三糖,P4主要是硫酸化單糖(/243)和硫酸化/二硫酸化二糖(/389、405、485)的混合物,P5主要是硫酸化單糖。與P4和P5相比,寡糖組分P3具有更高的分子質(zhì)量,同時(shí)也具有一定的硫酸基團(tuán)含量,這可能是導(dǎo)致P3抗凝血活性高于P4和P5主要原因。

    圖10 寡糖組分P3的結(jié)構(gòu)片段Fig. 10 Proposed sequence of oligosaccharide fraction P3

    圖11 寡糖組分P3的核磁共振氫譜Fig. 11 1H NMR spectrum of oligosaccharide fraction P3

    3 結(jié) 論

    從羊棲菜中提取并分離純化得到褐藻糖膠SFF。通過(guò)高效液相色譜法、高效凝膠滲透色譜法、化學(xué)法測(cè)定了褐藻糖膠的單糖組成、分子質(zhì)量、理化性質(zhì)。采用鹽酸降解法將SFF降解成寡糖,并通過(guò)Bio-gel P4凝膠色譜柱有效分離,最終得到5種寡糖組分P1~P5。5種寡糖組分均可延長(zhǎng)APTT,其中寡糖組分P1、P2、P3對(duì)APTT的延長(zhǎng)作用高于P4、P5,P3的延長(zhǎng)作用尤為明顯。5種寡糖組分對(duì)TT和PT無(wú)延長(zhǎng)作用,說(shuō)明SFF寡糖主要對(duì)內(nèi)源性和共同凝血途徑有抑制作用。選擇高抗凝血活性同時(shí)分子質(zhì)量最小的寡糖組分P3進(jìn)行質(zhì)譜分析,探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明,寡糖組分P3純度較高,主要由二硫酸化巖藻三糖寡糖片段組成,結(jié)構(gòu)為--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)--Fuc(2SO),--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)--Fuc(2SO),--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)--Fuc(3SO),--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)--Fuc(3SO)。本實(shí)驗(yàn)篩選出一種具有良好抗凝血活性的高純度寡糖組分,揭示其結(jié)構(gòu)特點(diǎn),豐富了抗凝血褐藻糖膠寡糖的研究。

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