液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)魚(yú)中氯霉素類和硝基咪唑類藥物殘留

摘 要：本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)魚(yú)肉中3種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。采用乙酸乙酯提取，提取液濃縮后純水定容，正己烷脫脂，在優(yōu)化的液相色譜條件下，3種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離。氯霉素類檢出限均為0.1 μg/kg，甲硝唑檢出限為0.5 μg/kg，其他硝基咪唑類均為1.0 μg/kg。在線性范圍（氯霉素類0.5～50.0 μg/L，硝基咪唑類2.0～100.0 μg/L）內(nèi)，相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)r>0.996 0，空白基質(zhì)3個(gè)添加水平的平均回收率為82.3%～109.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為3.6%～12.0%。本方法經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單和高效，能同時(shí)滿足魚(yú)肉中3種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：魚(yú)肉;氯霉素類;硝基咪唑類;藥物殘留;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀

LC-MS/MS Simultaneous Determination of Chloramphenicol and Nitroimidazole Residues in Fish

YONG Yanhua

（Dalian Center for Certification and Food and Drug Control， Dalian 116630， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry? method for simultaneous determination of 3 chloramphenicol and 5 nitroimidazole residues in fish was established. The extract was extracted with ethyl acetate， concentrated with pure water and degreased with n-hexane， under the optimized conditions of liquid chromatography， the 3 chloramphenicol and 5 nitroimidazole residues were separated well within 8 min. The detection limits of chloramphenicol， metronidazole and other nitroimidazole were 0.1 μg/kg， 0.5 μg/kg and 1.0 μg/kg respectively. In the linear range （chloramphenicol 0.5～50.0 μg/L， nitroimidazole 2.0～100.0 μg/L）， the correlation was good， and the linear correlation coefficient was r>0.996 0. The average recoveries were 82.3%～109.0% with relative standard deviations （n=6） of 3.6%～12.0% at 3 supplemental levels. The method is economical， rapid， simple and efficient， and this method can fully meet the requirement of simultaneous determination of 3 chloramphenicol and 5 nitroimidazole residues in fish.

Keywords： fish; chloramphenicol; nitroimidazole; drug residue; liquid chromatography-tandem mass

氯霉素類藥物為廣譜抗生素，具有良好的抗菌能力，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。氯霉素類藥物的毒副作用主要表現(xiàn)為對(duì)血液系統(tǒng)造成的毒性。硝基咪唑類藥物有致突變性和潛在的致癌性，很多國(guó)家已將其列為違禁藥物。歐盟在20世紀(jì)90年代已經(jīng)禁止洛硝噠唑、地美硝唑和甲硝唑用于可食用動(dòng)物，2002年美國(guó)食品與藥物管理局又公布了11種禁止在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中使用的藥物名單，其中包括硝基咪唑類藥物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局第227號(hào)公告中規(guī)定，甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑不允許以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在所有食用動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中使用。農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件規(guī)定，水產(chǎn)品中氯霉素、甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝唑均不得檢出，但是甲砜霉素在魚(yú)肉中限量50 μg/kg，氟苯尼考在魚(yú)肉中限量1 000 μg/kg、在其他動(dòng)物肌肉中為100 μg/kg。

氯霉素類藥物的檢測(cè)方法有很多，分別為酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，現(xiàn)在普遍使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[1-11]。檢測(cè)硝基咪唑類及其代謝物的方法有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法，主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-18]。但同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素類和硝基咪唑類及其代謝物的報(bào)道較少，標(biāo)準(zhǔn)《出口動(dòng)物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 3235—2012）中雖然包含了氯霉素和5種硝基咪唑類物質(zhì)，但未包含甲砜霉素和氟甲砜霉素，且需堿化乙腈、酸化乙腈各提取1遍，略顯煩瑣，此外使用的提取試劑乙腈毒性較強(qiáng)[19]。本文建立了同時(shí)檢測(cè)氯霉素族和硝基咪唑類藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，采用毒性較小的乙酸乙酯為提取試劑，進(jìn)行液液萃取，正己烷脫脂，檢出限可達(dá)到要求，重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便，可滿足魚(yú)肉中兩類藥物殘留的檢測(cè)要求，適合用于生產(chǎn)、流通、餐飲及進(jìn)出口環(huán)節(jié)的質(zhì)量監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1290/6495，美國(guó)Agilent公司）;均質(zhì)機(jī)（德國(guó)IKA公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）;CF16RXII立式大容量高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）;賽多利斯全自動(dòng)超純水機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）;Agilent poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×50.0 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent公司）。

實(shí)驗(yàn)中甲醇、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;無(wú)水硫酸鈉為分析純;甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑-D3、氯霉素、氯霉素-D5、氟甲砜霉素和甲砜霉素均為Dr.E公司生產(chǎn)，純度大于98%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氯霉素類：分別稱取氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品約0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。硝基咪唑類：分別稱取甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品約0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。氘代內(nèi)標(biāo)：分別稱取氯霉素-D5和羥甲基甲硝咪唑-D3標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.1 mL分別置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為100 μg/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取適量氯霉素類、硝基咪唑類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用20%甲醇逐級(jí)稀釋至氯霉素類的濃度為0.5 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L;硝基咪唑類的濃度為2.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、60.0 μg/L和100.0 μg/L;內(nèi)含5.0 μg/L氯霉素-D5和20.0 μg/L羥甲基甲硝咪唑-D3。

1.3 樣品前處理

稱取5.00 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于50 mL離心管中，加入20 μL羥甲基甲硝咪唑-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液、5 μL氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)中間液、25 mL乙酸乙酯及適量無(wú)水硫酸鈉，均質(zhì)1 min，12 000 r/min高速離心，將上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，再加入25 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并提取液至圓底燒瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。1 mL純水定容，2 mL正己烷脫脂，渦旋1 min，取水層過(guò)0.2 μm微孔有機(jī)濾膜，待測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18;柱溫：30 ℃;流動(dòng)相：A為純甲醇，B為高純水;梯度洗脫程序：0～1.5 min（25%A），1.5～4.1 min（25%～100%A）;4.1～6.5 min（100%A）;6.5～6.6 min（25%A）;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣體積：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜參數(shù)

電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）;

掃描方式：正負(fù)同時(shí)掃描;毛細(xì)管電壓：3 500 V;

監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，

MRM）;離子源溫度：200 ℃;去溶劑氣溫度：300 ℃;去溶劑氣：氮?dú)?3 L/min;錐孔氣：氮?dú)?2 L/min。其他參數(shù)詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

利用空白基質(zhì)加標(biāo)考察回收率，對(duì)提取試劑乙腈、甲醇和乙酸乙酯進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3者在回收率上無(wú)明顯差異，乙酸乙酯毒性較小，確定其為本實(shí)驗(yàn)的提取試劑。提取后，用正己烷脫脂，可提高回收率。

2.2 流動(dòng)相的選擇

氯霉素類藥物和硝基咪唑類的結(jié)構(gòu)決定了其可以在C18色譜上獲得分離。本實(shí)驗(yàn)探討了甲醇和乙腈對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩者均能較好地分離表1中的10種物質(zhì)，但考慮到價(jià)格和毒性等因素，最終選擇甲醇;氯霉素類為負(fù)模式采集，酸抑制負(fù)模式的電離，影響靈敏度，因此最終確定流動(dòng)相為純甲醇和高純水。在1.4.1所述梯度洗脫條件下，在8 min內(nèi)可獲得這10種物質(zhì)的最佳峰形，達(dá)到快速分析的目的。

2.3 線性范圍及檢出限

氯霉素類和硝基咪唑類分別在0.5～50.0 μg/L和2.0～100.0 μg/L濃度與峰面積成線性相關(guān)，線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。利用低濃度添加回收確定本方法氯霉素類檢出限為0.1 μg/kg，硝基咪唑類檢出限中甲硝唑?yàn)?.5 μg/kg，其他均為1.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

用空白魚(yú)肉基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法計(jì)算測(cè)定結(jié)果，以測(cè)定值對(duì)理論添加量的百分比表示回收率。每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，8種物質(zhì)的加標(biāo)回收均能滿足檢驗(yàn)需要。

2.5 實(shí)際樣品分析

利用本方法對(duì)市場(chǎng)銷售的50余份魚(yú)進(jìn)行檢測(cè)，其中，1份魚(yú)肉中檢出氯霉素0.32 μg/kg，1份魚(yú)肉中檢出甲硝唑5.21 μg/kg，其他樣品均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)檢測(cè)魚(yú)肉中3種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，此方法快速、高效、準(zhǔn)確，便于操作，可用于魚(yú)肉中3種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物殘留的日常檢測(cè)。

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