基于UPLC-QTOF-MS和多元統(tǒng)計(jì)分析的赤芝道地性研究△

張國亮，王曉彤，王漢波，趙建霞，李振宇，4，俞飛龍，4，李振皓，*

1.浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司，浙江 杭州 310000；2.浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司，浙江 武義 321200；3.壽仙谷珍稀藥材產(chǎn)品省級(jí)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)企業(yè)研究院，浙江 武義 321200；4.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江 武義 321200

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝G.sinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實(shí)體，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘等功效?，F(xiàn)代研究表明，靈芝具有良好的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖等生物活性[1-3]，在臨床上有廣泛應(yīng)用。靈芝酸是靈芝主要的小分子活性成分，從靈芝屬中分離出的靈芝酸類化合物已有300多個(gè)[4]。研究表明，靈芝酸類化合物不僅具有免疫調(diào)節(jié)活性[5]，而且對(duì)不同腫瘤均有較明顯的抑制作用，抗腫瘤機(jī)制包括阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，以及抑制轉(zhuǎn)移和血管生成等[6-7]。此外，靈芝酸還具有抗炎、抗氧化、抗菌和調(diào)血脂等活性[8]。

浙江有悠久的靈芝使用歷史，在浙江田螺山、余杭鎮(zhèn)南湖、湖州千金鎮(zhèn)塔地3 個(gè)新石器時(shí)代遺址出土的史前靈芝樣品將我國靈芝的應(yīng)用歷史追溯至6800 多年前[9]。歷代著作對(duì)浙江產(chǎn)靈芝也多有描述[10]。由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的《靈芝道地藥材》確定浙江為靈芝的道地產(chǎn)區(qū)之一。靈芝也是浙江省確定的新“浙八味”代表性品種之一。但是，道地與非道地產(chǎn)區(qū)靈芝在化學(xué)成分、生物活性上的差異缺少系統(tǒng)研究，不同種植方式（段木、代料、野生）、采收時(shí)期等對(duì)靈芝質(zhì)量的影響也尚未明確。本研究應(yīng)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS）對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、種植方式和采收時(shí)期的120 批赤芝樣品中的靈芝酸類成分進(jìn)行檢測，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)赤芝的道地性進(jìn)行分析，初步篩選出浙產(chǎn)赤芝的道地性標(biāo)志物，為闡明赤芝的道地性提供數(shù)據(jù)支撐，也為赤芝優(yōu)良品種選育、藥效物質(zhì)篩選提供參考。

1 材料

1.1 試藥

從浙江、安徽、四川、山東、福建5 個(gè)產(chǎn)區(qū)收集了120 批赤芝樣品，經(jīng)浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司朱衛(wèi)東高級(jí)農(nóng)藝師鑒定均為赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.，包括代料、段木和野生3 種種植方式，以及現(xiàn)蕾、開傘、成熟、采收4 個(gè)生長時(shí)期，見表1。

表1 赤芝樣品信息

對(duì)照品靈芝酸C2（批號(hào)：PS000597，純度：99.28%）、靈芝酸C1（批號(hào)：PS010882，純度：99.84%）、靈芝酸G（批號(hào)：PS010838，純度：96.76%）、靈芝烯酸B（批號(hào)：PS010839，純度：99.88%）、靈芝酸B（批號(hào)：PS010857，純度：99.41%）、靈芝烯酸A（批號(hào)：PS011374，純度：98.60%）、靈芝酸A（批號(hào)：PS010388，純度：99.89%）、赤芝酸A（批號(hào)：PS010891，純度：98.44%）、靈芝烯酸D（批號(hào)：PS010884，純度：99.51%）、靈芝酸D（批號(hào)：PS000598，純度：98.82%）、靈芝醇B（批號(hào)：PS011327，純度：98.64%）、靈芝醛A（批號(hào)：PS011330，純度：97.54%）、靈芝烯酸C（批號(hào)：PS010840，純度：99.87%）均購自成都普思生物科技股份有限公司；靈芝酸F（批號(hào)：CFS201903，純度≥98%）、靈芝酸DM（批號(hào)：CFS202001，純度≥98%）、靈芝酮三醇（批 號(hào)：CFS201903，純 度≥98%）、靈 芝 醇F（CFS201902，純度≥98%）均購自武漢普標(biāo)科技有限公司；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技公司）；甲醇、甲酸（色譜純，美國默克公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC I-Class Plus 型超高效液相色譜儀、SYNAPT XS 型高分辨質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 型色譜柱（美國Waters 公司）；XS205DU 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Minispin 型高速離心機(jī)（德國艾本德公司）；KQ52000E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct Q5型超純水儀（德國默克密理博公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取17 個(gè)靈芝酸對(duì)照品適量，加色譜級(jí)甲醇搖勻使其充分溶解，并定容，配制成終質(zhì)量濃度為0.05 mg·mL-1的單一對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取受試樣品各0.5 g，置具塞錐形瓶中，加色譜級(jí)甲醇50 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，冷卻，用0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，待UPLC-QTOF-MS分析。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，20%B；0～2 min，20.0%～26.5%B；2～9 min，26.5%B；9～19 min，26.5%～35.0%B；19～28 min，35.0%～60.0%B；28～32 min，60.0%～70.0%B；32～37 min，70.0%～90.0%B；37～40 min，90.0%～100.0%B；40～45 min，100.0%B）；流速為0.45 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件：ExionLC ?AC 液相系統(tǒng)，串聯(lián)X500R QTOF 質(zhì)譜系統(tǒng)；電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1500；霧化氣（Gas1）壓力為379 kPa，干燥氣（Gas2）壓力為413 kPa，氣簾氣（Cur）壓力為241 kPa，碰撞氣（CAD）壓力為48 kPa；離子源溫度為600 ℃；離子源負(fù)離子時(shí)電壓為-4500 V、正離子時(shí)電壓為4000 V。

2.3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)通過SCIEX OS 1.5 進(jìn)行處理，對(duì)靈芝酸進(jìn)行鑒定，獲取相應(yīng)的峰面積；采用SIMCA 14.1的正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）模塊進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析；以模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率（R2X、R2Y）、模型的預(yù)測能力（Q2）等指標(biāo)評(píng)價(jià)聚類效果，通過變量重要性投影（VIP）值（VIP＞1）和t檢驗(yàn)（P＜0.05）篩選差異化合物。

3 結(jié)果與分析

3.1 赤芝化學(xué)成分鑒定

17 個(gè)對(duì)照品分別在正、負(fù)離子條件下進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，并根據(jù)分析結(jié)果建立譜庫。從對(duì)照品總離子流圖看，靈芝酮三醇、靈芝醇F、靈芝醇B、靈芝醛A 在正、負(fù)離子條件下均未出峰，且以準(zhǔn)分子離子或加酸峰離子等也未提取到目標(biāo)峰，推測這些成分在現(xiàn)有分析條件下響應(yīng)不佳，可能與電離模式有較大關(guān)系。其余13 個(gè)靈芝酸類化合物響應(yīng)高、分離度好且峰形良好，適用于定性定量分析。13 個(gè)對(duì)照品、樣品的質(zhì)譜信息見表2，總離子流圖見圖1。

圖1 赤芝樣品與對(duì)照品總離子流圖

表2 赤芝中靈芝酸類化合物質(zhì)譜信息

3.2 基于層次聚類的赤芝道地性分析

結(jié)合對(duì)照品的二級(jí)質(zhì)譜圖，從赤芝中鑒定了13 個(gè)靈芝酸類成分。根據(jù)這些成分在不同赤芝樣品中的相對(duì)含量，應(yīng)用ward.D2 算法進(jìn)行層次聚類分析（圖2）。如圖2A所示，盡管多數(shù)同產(chǎn)區(qū)的赤芝可以聚為一類，但仍有不少樣品未能較好的聚類。這主要是因?yàn)闄z測的赤芝樣品在種植方式和采收時(shí)期上存在較大差異，這些差異使得靈芝酸的含量發(fā)生變化，導(dǎo)致層次聚類法不能很好地將浙產(chǎn)和非浙產(chǎn)赤芝區(qū)分。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為7～9、19～21、25～30的樣品中靈芝烯酸C、靈芝酸C2、靈芝酸A、靈芝酸DM、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝酸G、靈芝酸C1的相對(duì)含量普遍高于其他樣品。編號(hào)為85～93、97～111 的樣品中靈芝酸B、靈芝酸G、靈芝酸C1、靈芝酸F、靈芝酸D、靈芝烯酸D的相對(duì)含量普遍高于其他樣品。此外，通過對(duì)樣品中各靈芝酸的相關(guān)性進(jìn)行分析（圖2B），發(fā)現(xiàn)多數(shù)靈芝酸呈現(xiàn)較好的正相關(guān)。關(guān)，其中靈芝酸C1和靈芝酸F，靈芝酸C2和靈芝烯酸C，靈芝酸B 和靈芝酸G 等的相關(guān)性較強(qiáng)，可能因?yàn)檫@些成分的生物合成途徑較為接近，為靈芝酸的生物合成調(diào)控研究提供了參考。

圖2 基于層次聚類的赤芝道地性分析

3.3 基于多元統(tǒng)計(jì)分析的赤芝道地性分析

根據(jù)產(chǎn)地信息，將樣品分為浙產(chǎn)和非浙產(chǎn)2 個(gè)組別，通過OPLS-DA 模型對(duì)兩組進(jìn)行差異成分分析（圖3）。模型的R2X=0.866，R2Y=0.903，Q2=0.883，說明該模型擬合及預(yù)測能力良好。如圖3A所示，浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)赤芝樣品可在得分圖中明顯聚為2 類，說明兩者間的化學(xué)成分存在明顯差異。通過VIP 值對(duì)差異靈芝酸進(jìn)行篩選，以VIP 值＞1 為限值，篩選出靈芝酸D、靈芝烯酸B、靈芝烯酸D 等差異成分，表明這些成分對(duì)聚類有較大貢獻(xiàn)（圖3B）。其中靈芝酸D、靈芝烯酸D 在浙產(chǎn)赤芝樣品中顯著高于非浙產(chǎn)赤芝（圖3C～D），可以作為浙產(chǎn)赤芝的標(biāo)志性成分。對(duì)浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)赤芝樣品中靈芝酸D、靈芝烯酸B、靈芝烯酸D 含量進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖4）。

圖3 基于OPLS-DA的浙產(chǎn)和非浙產(chǎn)赤芝差異性分析

圖4 浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)赤芝差異性成分

3.4 浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)段木赤芝差異性分析

不同產(chǎn)地赤芝的種植方式存在較大差異，如浙江赤芝以段木栽培為主，山東以代料栽培為主，安徽2 種模式都有應(yīng)用。本研究收集了21 份非浙產(chǎn)段木赤芝和51 份浙產(chǎn)段木赤芝，為減少不同因素對(duì)聚類造成的差異，進(jìn)一步用OPLS-DA 分析了浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)段木赤芝的差異成分（圖5）。模型的R2X=0.939，R2Y=0.932，Q2=0.918，說明該模型擬合及預(yù)測能力良好。

如圖5A 所示，浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)段木赤芝樣品可明顯聚為2 類，說明兩者間的成分存在明顯差異。VIP值＞1 的化合物有4 個(gè)（圖5B），對(duì)其進(jìn)行t檢驗(yàn)，4 個(gè)成分在2 組樣品中含量顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖6），且浙產(chǎn)段木赤芝樣品中靈芝酸D、靈芝酸B、靈芝酸C1、靈芝酸G的含量均高于非浙產(chǎn)段木赤芝。這可能與各產(chǎn)地的環(huán)境氣候有較大關(guān)系，浙江的環(huán)境氣候有利于靈芝酸D等4個(gè)靈芝酸的積累。

圖5 基于OPLS-DA的浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)段木赤芝差異性分析

圖6 浙產(chǎn)與非浙產(chǎn)段木赤芝差異性成分

3.5 浙產(chǎn)段木與野生赤芝差異性分析

選取采收期的27份浙產(chǎn)段木赤芝及12份浙產(chǎn)野生赤芝，通過OPLS-DA 模型對(duì)2 組進(jìn)行差異性分析，比較人工栽種赤芝與野生赤芝的質(zhì)量差異（圖7）。模型的R2X=0.983，R2Y=0.952，Q2=0.917，說明該模型擬合及預(yù)測能力良好。如圖7A所示，浙產(chǎn)段木赤芝與野生赤芝可明顯聚為2 類，說明兩者間的成分存在明顯差異。野生赤芝的組內(nèi)差異較大，而段木赤芝的組內(nèi)差異較小，也說明人工種植有利于確保藥材的質(zhì)量一致性。VIP 值＞1 的化合物有5 個(gè)（圖7B），對(duì)其進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖8），且段木赤芝中靈芝烯酸D、靈芝烯酸B、靈芝烯酸A、靈芝烯酸C、靈芝酸A 5 個(gè)成分相對(duì)含量均高于野生赤芝。

圖7 基于OPLS-DA的浙產(chǎn)段木與野生赤芝差異性分析

圖8 浙產(chǎn)段木與野生赤芝差異性成分

3.6 不同發(fā)育時(shí)期赤芝差異性分析

通過OPLS-DA 模型對(duì)武義產(chǎn)區(qū)現(xiàn)蕾期、開傘期、成熟期和采收期4 個(gè)發(fā)育階段共36 份赤芝樣品進(jìn)行聚類分析。模型的R2X=0.990，R2Y=0.865，Q2=0.785，說明該模型擬合及預(yù)測能力良好。如圖9A所示，不同發(fā)育時(shí)期赤芝樣品聚類效果明顯，說明成分存在明顯差異。VIP 值＞1 的化合物有3 個(gè)（圖9B），分別是靈芝酸DM（圖9C）、靈芝烯酸B（圖9D）和靈芝烯酸C，表明這些成分對(duì)聚類貢獻(xiàn)較大，是主要的差異成分。用平行坐標(biāo)圖直觀展示不同發(fā)育時(shí)期靈芝酸含量的差異（圖10），可發(fā)現(xiàn)現(xiàn)蕾期樣品靈芝酸含量相對(duì)較高，隨著子實(shí)體逐漸成熟，多數(shù)靈芝酸含量有下降的趨勢。

圖9 基于OPLS-DA的不同發(fā)育時(shí)期赤芝差異性分析

圖10 赤芝不同發(fā)育時(shí)期靈芝酸相對(duì)含量變化

4 討論

我國靈芝種類達(dá)100 多種，分布最廣地區(qū)在南嶺南北，包括廣東、廣西、福建、臺(tái)灣南部、海南、香港，以及云南西雙版納、西藏的察隅和墨脫及林芝地區(qū)。由于各產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境差異，靈芝品種數(shù)量及優(yōu)勢菌株差異較大[11]。吳鴻雪等[12]對(duì)不同品種、不同基質(zhì)、不同生長時(shí)期的靈芝子實(shí)體的總靈芝酸含量、單體靈芝酸含量及抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)不同樣品單個(gè)靈芝酸含量變化較大，但總靈芝酸含量差異較小，體外抗腫瘤作用也相近。金鑫等[13]對(duì)不同生長期靈芝的農(nóng)藝性狀和多糖含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)成熟期多糖含量達(dá)到最高值。郭曉蕾等[14]應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜評(píng)價(jià)了不同產(chǎn)地靈芝樣品的相似性，發(fā)現(xiàn)除個(gè)別樣品外，各產(chǎn)地樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度都較高。本研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)、不同栽培條件、不同生長時(shí)期赤芝的化學(xué)成分存在較明顯差異。

液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是一種集高效分離與高靈敏度、高選擇性檢測于一體的現(xiàn)代分離分析技術(shù)，可同時(shí)測定數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)成分，近年來在中藥化學(xué)分析中得到了廣泛運(yùn)用[15-16]。在本研究中，利用UPLC-QTOF-MS 同時(shí)檢測了赤芝中13 種靈芝酸類成分，并對(duì)不同產(chǎn)地、不同栽培方式、不同發(fā)育時(shí)期的樣品進(jìn)行分析，可以更全面地評(píng)價(jià)赤芝的道地性。

通過綜合運(yùn)用UPLC-QTOF-MS和多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地赤芝樣品在化學(xué)成分上有較為明顯的差異。靈芝酸D、靈芝烯酸D 在浙產(chǎn)赤芝樣品中顯著高于非浙產(chǎn)赤芝，說明浙江的氣候環(huán)境容易使這2 個(gè)成分在赤芝中蓄積，可作為浙產(chǎn)赤芝的標(biāo)志性成分。進(jìn)一步對(duì)浙產(chǎn)和非浙產(chǎn)段木赤芝進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)靈芝酸D、靈芝酸B、靈芝酸C1、靈芝酸G 4個(gè)成分含量均顯著高于非浙產(chǎn)段木赤芝，其中靈芝酸D提高了近8 倍。靈芝酸D 可以通過激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）通路發(fā)揮抗衰老作用[17]，也具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[18]。靈芝烯酸D 為潛在的抗腫瘤活性成分[19]。靈芝酸B 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷有良好的保護(hù)作用[20]，可通過逆轉(zhuǎn)ATP 結(jié)合蛋白亞家族1 抗體（ABCB1）介導(dǎo)的多藥耐藥來恢復(fù)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[21]，對(duì)人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）蛋白酶有明顯的抑制作用[22]。靈芝酸C1則表現(xiàn)出很好的抗炎作用[23]。上述研究結(jié)果也提示，靈芝酸含量的改變可能導(dǎo)致赤芝相應(yīng)的生物活性發(fā)生變化，可進(jìn)一步應(yīng)用報(bào)道的模型比較研究浙產(chǎn)和非浙產(chǎn)赤芝在生物活性上的差異。

野生藥材與人工栽培藥材孰優(yōu)孰劣，一直存在不同的看法。本研究也對(duì)浙產(chǎn)段木和野生赤芝的差異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人工栽培的段木赤芝中靈芝烯酸D、靈芝酸A 等成分均顯著高于野生赤芝。此外，不同批的段木赤芝也表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，這有助于確保臨床療效的一致性。靈芝酸A 具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、恢復(fù)肝損傷、抗關(guān)節(jié)炎等多種藥理活性，是具有開發(fā)前景的候選藥物[24-27]。后續(xù)應(yīng)結(jié)合體內(nèi)、體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)野生與人工栽培赤芝活性的差別。

本研究也發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期赤芝樣品中，靈芝酸含量有較大差異?？傮w而言，現(xiàn)蕾期樣品中靈芝酸含量較高，開傘期次之，成熟期和采摘期相對(duì)較低，與文獻(xiàn)[28]報(bào)道較為一致。通常認(rèn)為產(chǎn)孢赤芝在噴孢子粉后（采摘期），靈芝酸等活性成分會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢。本研究也發(fā)現(xiàn)，有些品種成熟期和采摘期靈芝酸的含量差異較大，一些品種在噴粉后，靈芝酸含量并沒有顯著下降。從綜合利用角度考慮，這些品種既可提供孢子粉原料，也可作為赤芝子實(shí)體（飲片）原料，且不損失活性，有較大的開發(fā)價(jià)值。下一步計(jì)劃檢測噴粉前后生物活性的變化，并從分子育種角度，對(duì)其種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，選育出高活性的新赤芝品種。

本研究較為全面地對(duì)赤芝的道地性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，初步篩選出具有特征性的浙產(chǎn)赤芝化學(xué)標(biāo)志物。有研究表明，地理和氣候等因素所致的土壤環(huán)境異質(zhì)性，以及內(nèi)生菌、微生物等微生態(tài)的因素對(duì)道地性有重要影響[29-30]。因此，后續(xù)研究也可以對(duì)不同產(chǎn)地的土壤及其微生態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)合遺傳因素等及人工智能、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等先進(jìn)算法，更全面地闡明赤芝道地性形成機(jī)制。也需要結(jié)合不同層次的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡釋和驗(yàn)證，并結(jié)合臨床研究，為道地藥材的療效優(yōu)越性提供數(shù)據(jù)支撐。