皮膚病血毒丸的HPLC指紋圖譜研究

林忠澤，張清民，盛釗君，鄧煜然，袁潔麗，林 芳

1.特一藥業(yè)集團股份有限公司，江門 529200；2.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江門 529000；3.五邑大學(xué)，江門 529000

皮膚病血毒丸為民國時期京城四大名醫(yī)施今墨所創(chuàng)，由茜草、黃柏、金銀花、當歸、川芎、大黃、連翹、牡丹皮等多味中藥組成，具有清熱解毒、消腫止癢的功效。皮膚病血毒丸在臨床應(yīng)用上可針對皮膚病的病因，從清熱解毒、消腫止癢、調(diào)節(jié)機體功能3個方面入手，通過清除體內(nèi)毒素達到外病內(nèi)治的目的，因此可用于多種皮膚科疾病的治療，而用于治療痤瘡的療效尤為顯著［1-4］?，F(xiàn)行皮膚病血毒丸的國家藥品標準［5］僅有薄層色譜的鑒別實驗，缺乏對其內(nèi)在質(zhì)量的控制手段，目前也只有2篇關(guān)于測定皮膚病血毒丸中大黃素與大黃酚含量的文獻［6-7］。中藥指紋圖譜是一種綜合地反映中藥多成分特征的質(zhì)量控制模式，可用于比較不同樣品之間的成分相似性，是目前中藥整體質(zhì)量評價的重要手段［8-10］。為能夠評價和控制皮膚病血毒丸的質(zhì)量，本研究參考中藥指紋圖譜相關(guān)文獻［11-21］，用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）建立皮膚病血毒丸的指紋圖譜，為對其內(nèi)在質(zhì)量進行有效控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ulti Mate3000型高效液相色譜儀（包括Chromatpgraphy Data System 7.2 色 譜 工 作 站）、Evolution 201紫外可見光分光光度計均購自賽默飛世爾科技有限公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ML204T 電子天平（萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

皮膚病血毒丸14批（特一藥業(yè)集團股份有限公司，批 號 分 別 為35200601、35200602、35200603、35201101、35201201、35210101、35210102、35210201、35210202、35210203、35210301、35210302、35210303、35210304，編號分別為S1～S14）。

對照品：沒食子酸（批號110831-201204）、綠原酸（批號110753-201817）、阿魏酸（批號110773-201614）、丹皮酚（批號110708-201908）、大黃酸（批號110757-201607）、大黃酚（批號110796-201621）、大黃素甲醚（批號110758-201415）、大葉茜草素（批號110884-201606）均購自中國食品藥品檢定研究院。

對照藥材：金銀花（批號121060-201608）、茜草（批號121049-201705）、大黃（批號120984-201202）、川芎（批號120918-201813）、當歸（批號120927-201617）、連翹（批號120908-201817）、牡丹皮（批號121490-201603）、黃柏（批號121510-201807）均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

AcclaimTM120 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）。流動相：乙腈（A）-1 m L·L－1磷酸溶液（B）。梯度洗脫：0～8.5 min，3%A～8%A；8.5～13 min，8%A～15%A；13～30 min，15%A～26%A；30～31 min，26%A～29%A；31～40 min，29%A～48%A；40～50 min，48%A ～80%A；50～55 min，80%A～95%A；55～60 min，95%A～100%A。流速：1.0 m L·min－1。柱溫：25℃。檢測波長：280 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、丹皮酚、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、大葉茜草素對照品適量，用甲醇配制成每1 m L含沒 食 子 酸41.4 μg、綠 原 酸0.413 mg、阿 魏 酸28.1μg、丹皮酚20.0μg、大黃酸54.2μg、大黃酚55.6μg、大黃素甲醚26.0μg、大葉茜草素0.104 4 mg的各單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取皮膚病血毒丸適量，除去包衣，研細，取約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)70%的甲醇25 m L，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 k Hz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分數(shù)70%的甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對照藥材溶液的制備 分別取金銀花、茜草、大黃、川芎、當歸、連翹、牡丹皮、黃柏對照藥材適量，分別按2.2.2項下方法制備成各對照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，按照2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以3號共有峰（綠原酸）為參照峰（S峰），計算得各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.05%～0.81%，相對峰面積的RSD 值為0.19%～1.89%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實驗 取同一樣品，按照2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定。計算得各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.02%～0.74%，相對峰面積的RSD 值為0.19%～1.89%，表明儀器的精密度良好且該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，按照2.1項下色譜條件下于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.04%～0.52%，相對峰面積的RSD 值為0.30%～2.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 取14批皮膚病血毒丸，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，結(jié)果見圖1。將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A 版）”軟件進行分析，對各指紋圖譜峰進行自動匹配和多點校正，擬合得到皮膚病血毒丸的標準對照圖譜，結(jié)果見圖2。

圖1 14批（S1～S14）皮膚病血毒丸的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches（S1～S14）of Pifubing Xuedu Pills

圖2 皮膚病血毒丸的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of Pifubing Xuedu Pills

對樣品進行相似度分析，14批樣品的相似度在0.987～0.999范圍內(nèi)，結(jié)果見表1。同時確定20個共有峰，其中3號峰（綠原酸）峰形對稱、分離度好、峰面積大，因此選其作為參照峰（S峰），以計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、表3。

表1 相似度評價結(jié)果Tab.1 Results of similarity evaluation

表2 共有峰相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相對峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks

2.4.2 共有峰的指認和藥材歸屬 分別吸取皮膚病血毒丸供試品溶液、各對照藥材溶液和對照品溶液，按照2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 皮膚病血毒丸與對照藥材溶液的HPLC圖Fig.3 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their control medicinal herbs solution

圖4 皮膚病血毒丸與對照品溶液的HPLC圖Fig.4 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their reference substances solution

根據(jù)圖譜各峰保留時間的比對分析，對供試品溶液中的相應(yīng)色譜峰進行歸屬指認，其中1號峰為沒食子酸、3號峰為綠原酸、6號峰為阿魏酸、15號峰為牡丹酚、17號峰為大黃素、18號峰為大黃酚、19號峰為大黃素甲醚、20號峰為大葉茜草素；5、6、16號峰歸屬連翹，3、6、9、10號峰歸屬川芎，1、8、15號峰歸屬牡丹皮，1、3、17、18、19號峰歸屬大黃，4號峰歸屬黃柏，20號峰歸屬茜草，6、10號峰歸屬當歸，3、9、10號峰歸屬金銀花。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究考察了乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L－1冰醋酸溶液和乙腈-0.5 m L·L－1三氟乙酸溶液等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時，色譜峰基線平穩(wěn)、峰形較好，故選擇乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液為流動相系統(tǒng)。在選定的流動相系統(tǒng)條件下，對254、280、330 nm 等波長進行篩選，發(fā)現(xiàn)在280 nm 處吸收最強，在該檢測波長處，皮膚病血毒丸供試品溶液的色譜峰基線平穩(wěn)，信息響應(yīng)度強，數(shù)量較多，分離效果好，確定280 nm 為指紋圖譜的最佳檢測波長。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

本實驗考察了以體積分數(shù)50%的甲醇、體積分數(shù)為70%的甲醇和甲醇為提取溶劑，分別采用超聲和加熱回流方法提取，并考察了不同提取時間（超聲提取15、30、45 min，回流提取30、45、60 min）對結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，將體積分數(shù)為70%的甲醇作為提取溶劑、超聲提取30 min獲得的色譜峰峰形較好而且響應(yīng)值較好，故最終選擇以體積分數(shù)為70%的甲醇作為提取溶劑、超聲30 min作為供試品制備方法。

3.3 小結(jié)

皮膚病血毒丸制備工藝為組方中藥飲片粉碎至細粉泛丸而成，組方中的茜草、黃柏、金銀花、當歸、川芎、大黃、連翹、牡丹皮是發(fā)揮清熱解毒、消腫止癢、活血通絡(luò)、瀉火通便藥效的主要成分，能蕩滌臟腑熱邪、發(fā)汗去邪、通便排毒、調(diào)整機體功能，達到恢復(fù)皮膚健康的目的，因此選用這8味藥材作為研究皮膚病血毒丸的主要對象。本研究建立皮膚病血毒丸HPLC 指紋圖譜，標定20個共有峰，并進行共有峰的歸屬，指認8種主要特征成分，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2004A 版）”對14批皮膚病血毒丸的指紋圖譜進行相似度評價，相似度在0.987～0.999范圍內(nèi)，相對保留時間的RSD 值在0.04～0.62范圍內(nèi)，表明不同批次的皮膚病血毒丸化學(xué)成分大致相同，其生產(chǎn)質(zhì)量較為穩(wěn)定。

綜上所述，該方法操作簡單快捷，穩(wěn)定性好，能夠較好地反映皮膚病血毒丸的化學(xué)成分，用該方法評價皮膚病血毒丸的質(zhì)量，可以彌補現(xiàn)行質(zhì)量標準的不足和完善相關(guān)評價系統(tǒng)，為有效評價和控制皮膚病血毒丸的質(zhì)量提供參考。