新型鴨呼腸孤病毒σB蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定

華炯鋼，葉偉成，倪 征，陳 柳，朱寅初，云 濤，張 存

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021）

鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）分為兩種基因型，即Ⅰ型和Ⅱ型[1-2]?；颌裥蜑榻?jīng)典鴨呼腸孤病毒（Classical DRV，CDRV），即番鴨呼腸孤病毒（Muscovey duck reovirus，MDRV），主要感染番鴨和半番鴨，引起鴨壞死性肝炎（俗稱番鴨“白點病”或“花肝病”），以肝脾等臟器組織出現(xiàn)大量粟狀壞死灶為病理特征，該基因型自1997 年以來在我國廣東、廣西、福建、浙江和江西等省流行[3]?；颌蛐蜑樾滦网喓裟c孤病毒（Novel DRV，NDRV），可引起番鴨、半番鴨、北京鴨和鵝等發(fā)病，特征性病變?yōu)楦纹⒊霈F(xiàn)嚴重壞死和出血（俗稱“出血性壞死性肝炎”），NDRV 最早發(fā)現(xiàn)于2000年，此后開始在我國江蘇、浙江、福建、廣東、河北、山東等省暴發(fā)與流行[2,4-5]。目前，NDRV 已成為我國流行的優(yōu)勢基因型[1-2,6]。

NDRV 基因組由10 個節(jié)段的雙鏈RNA 構(gòu)成，全長23 419 bp。病毒粒子由二十面體對稱的雙層衣殼組成，直徑70 nm，無囊膜。根據(jù)SDS-PAGE 電泳結(jié)果，將NDRV 基因組分為3 個群，分別是：L 組群（L1、L2、L3）、M 組群（M1、M2、M3）和S 組群（S1、S2、S3、S4）[2-3,5-6]。其中S3 節(jié)段編碼的σB 是NDRV 衣殼的主要組分和外衣殼蛋白，其功能與哺乳動物呼腸孤病毒（Mammalian reovirus，MRV）的σ3蛋白、雞呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）及CDRV的σB 蛋白類似，均能夠誘導(dǎo)宿主機體產(chǎn)生群特異性中和抗體[7-8]。ARV 與CDRV 的σB 蛋白存在保守的群特 異 性 抗 原 表 位[9-10]。NDRV 與CDRV 為DRV 不 同 的基因型，且DRV 與ARV 均屬于禽正呼腸孤病毒（Avian orthoreovirus，ARVs）成員；NDRV σB 蛋白與ARV及CDRV σB 蛋白的氨基酸序列同源性約為60%和70%[2-3,6]。目前NDRV σB 蛋白的抗原表位及其是否存在群特異性抗原表位尚不清楚。因此，本實驗利用原核表達的NDRV σB 蛋白作為免疫原，通過免疫小鼠篩選并制備了該蛋白的單克隆抗體（MAb），并對其識別的抗原表位進行鑒定，為進一步建立NDRV 特異性檢測方法及研發(fā)表位標記疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒株及實驗動物骨髓瘤細胞（SP2/0）、雞胚成纖維細胞（DF-1）、ARV S1133株均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室保存；NDRV ZJ00M 株和CDRV ZJ2000M 株由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室分離鑒定與保存[2,6]；大腸桿菌DH5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-28a-SUMO 載體由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室構(gòu)建、保存。6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑HRP標記的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG4000、次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）、次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷（HT）均購自Sigma 公司；MAb 亞類鑒定試劑盒購自賽默飛公司；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司；Ni-NTA kit 購自Novagen 公司。

1.3 重組質(zhì)粒pET-28a-SUMO-σB 的構(gòu)建、蛋白表達及純化利用Oligo6.0 軟件，以NDRV ZJ00M 株S3 節(jié)段全序列（KF154118）編碼的σB 基因ORF 為靶區(qū)域設(shè)計引物：SigB-F： 5'-CGCGGATCCATGGAGGT GCGTGTGCCAAAC-3'（BamH I）/SigB-R：5'-GCACTC GAGTTACCACCTACACTCCAGGAAG-3'（XhoI），擴增片段大小為1 104 bp，引物由Invitrogen 公司合成。提取NDRV ZJ00M 株RNA 并作為模板，采用上述引物經(jīng)RT-PCR 擴增σB 基因片段，用BamH I/XhoI 分別雙酶切目的片段σB 和載體pET-28-SUMO，經(jīng)T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28-SUMOσB，并經(jīng)BamH I 和XhoI 雙酶切及測序鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28-SUMO-σB 轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達，離心，超聲破碎，分離上清液和沉淀。通過SDS-PAGE 檢測表達情況。利用Ni-NTA 試劑盒對重組σ 蛋白（rσB）純化后通過SDSPAGE檢測其純度，并利用核酸蛋白儀測定rσB濃度。

1.4 小鼠的免疫選取6 周齡～8 周齡的BALB/c 小鼠，將純化的rσB 與弗氏完全佐劑等體積混合乳化后，采用頸背部皮下多點注射免疫（100 μg/只）。間隔2 周免疫一次，共免疫3 次。第二次和第三次免疫時用rσB 與等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免7 d 后尾部采血，分離血清，2 倍倍比稀釋，利用純化的rσB 作為包被抗原，通過間接ELISA 方法[11]檢測血清抗體效價，選擇血清效價最高的小鼠，于融合前3 d再用rσB（100 μg/只）加強免疫，利用PEG4000 將小鼠脾細胞與SP2/0 細胞按常規(guī)方法融合[12]。

1.5 細胞融合及MAb 的制備細胞融合7 d 后，取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)1.4 中的間接ELISA 方法檢測以篩選陽性雜交瘤細胞，以1.4 中獲得的NDRV rσB 的小鼠陽性血清為陽性對照，以未融合的SP2/0細胞上清液為陰性對照。采用有限稀釋法對檢測的陽性雜交瘤細胞進行3 次克隆純化，直至篩選結(jié)果100%為陽性。對篩選出能夠穩(wěn)定分泌MAb 的雜交瘤細胞按常規(guī)方法制備腹水[12]，采用親和層析方法純化腹水MAb，通過上述間接ELISA 方法檢測雜交瘤上清液和純化的腹水MAb 效價。

1.6 MAb 亞類鑒定利用MAb 亞類鑒定試劑盒鑒定MAb 的亞類。

1.7 MAb 反應(yīng)原性的western blot 鑒定將NDRV ZJ00M 株以MOI 0.01 感染DF-1 細胞，以不感染病毒的DF-1 細胞作為空白對照。72 h 后收獲DF-1細胞，煮沸裂解后離心，取上清液，以制備的MAb（1∶5 000）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，通過western blot 檢測MAb 與天然表達的σB 蛋白的反應(yīng)性。

1.8 MAb 交叉反應(yīng)性的間接免疫熒光試驗（IFA）分別將NDRV ZJ00M 株、CDRV ZJ2000M 株和ARV S1133株均以MOI 0.01感染DF-1細胞，培養(yǎng)48 h后固定細胞，分別以制備的MAb（1∶2 000），1.4 中獲得的小鼠rσB 陽性血清（1∶100）和未免疫小鼠血清（1∶100）作為一抗，羊抗鼠IgG-FITC（1∶1 000）為二抗，經(jīng)IFA鑒定本研究制備的MAb 對CDRV、ARV 是否有交叉反應(yīng)性。

1.9 MAb 抗原表位的肽掃描法鑒定將σB 蛋白截短成長度為15 個氨基酸、相互重疊5 個氨基酸的多肽，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，共37 條（表1），將多肽用DMSO 溶解后，分別以1 μg/孔包被ELISA板，以制備的各MAb（1∶5 000）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，經(jīng)ELISA篩選各MAb的抗原表位，以1.4中制備的rσB高免小鼠血清為一抗作為陽性對照，以未免疫小鼠血清為一抗作為陰性對照。

將37 條σB 蛋白多肽中與各MAb ELISA 檢測呈強陽性的多肽繼續(xù)以2 個氨基酸為步移，從N 端和C 端再分別逐步截短并合成，共合成8 條多肽（表1）。將這8 條多肽分別包被ELISA 板，采用上述ELISA 方法繼續(xù)篩選各MAb 的抗原表位。

表1 根據(jù)σB蛋白氨基酸序列合成的重疊多肽序列Table 1 Overlapping peptides synthesized according to the amino acid sequence of σB protein

1.10 抗原表位的保守性分析從GenBank 選取不同年代、不同地域且具有代表性的NDRV 與CDRV 分離株，以及鵝呼腸孤病毒（GRV）、新型鵝呼腸孤病毒（Novel GRV，NGRV）、ARV 和火雞呼腸孤病毒（Turkey reovirus，TARV）等ARVs 成員的代表性病毒，對各病毒中的σB 蛋白氨基酸序列進行比對分析，以確定抗原表位的保守性。

2 結(jié) 果

2.1σB 蛋白的原核表達、鑒定及純化結(jié)果重組質(zhì)粒pET-SUMO-σB 經(jīng)BamH I 和XhoI 雙酶切鑒定及測序鑒定結(jié)果顯示，σB 基因正確插入pET-28a-SUMO 載體中。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-SUMO-σB轉(zhuǎn)化BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達后經(jīng)SDSPAGE 檢測結(jié)果顯示，重組蛋白主要以包涵體的形式表達，分子量約為55 ku，與預(yù)期大小相符；經(jīng)Ni-NTA His 柱純化后獲得了單一目的條帶（圖1）。表明，rσB 獲得了表達，且純化效果較好。經(jīng)計算該蛋白純度約為85%，經(jīng)核酸蛋白儀測定該蛋白濃度為1 mg/mL。

圖1 rσB表達與純化的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of expression and purification of recombinant σB protein by SDS-PAGE

2.2 McAbs 亞類鑒定及腹水效價的測定結(jié)果將小鼠脾細胞與SP2/0 細胞融合后，經(jīng)間接ELISA 方法篩選，對篩選獲得的陽性雜交瘤細胞株經(jīng)過3 次克隆純化，最終獲得3 株穩(wěn)定分泌NDRV σB 蛋白MAb的雜交瘤細胞株，其分泌的MAb 分別命名為10-A5、A1-G9 和B7-E5。間接ELISA 檢測結(jié)果顯示，3株雜交瘤細胞上清液中的抗體效價均為1∶1 280，腹水中的MAb 經(jīng)純化后效價均為1∶240 000?？贵w亞類鑒定結(jié)果顯示，3 株MAb 均為IgG1，分泌的抗體輕鏈均為κ。

2.3 MAb 反應(yīng)原性的western blot 鑒定結(jié)果將NDRV 感染DF-1 細胞72 h 后收獲細胞，通過western blot 鑒定上述3 株MAb 的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示，3 個MAb 均在41 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而陰性對照DF-1 細胞無該條帶（圖2）。制備的10-A5、A1-G9 和B7-E5 均能夠與NDRV 感染DF-1 細胞的σB 蛋白發(fā)生反應(yīng)，表明3 株MAb 均能夠識別NDRV 天然表達的σB 蛋白，反應(yīng)原性較強。

圖2 MAb反應(yīng)原性的western blot 鑒定Fig.2 Identification of MAbs reactivity by western blot

2.4 MAb 交叉反應(yīng)性的IFA 鑒定結(jié)果分別將NDRV、CDRV 和ARV 感染DF-1 細胞，并設(shè)相應(yīng)的對照，經(jīng)IFA鑒定MAb的交叉反應(yīng)性。結(jié)果顯示：分別以3 株MAb 及小鼠陽性血清為一抗時，感染NDRV的DF-1 細胞均出現(xiàn)了亮綠色熒光；而感染CDRV 和ARV的DF-1細胞均無綠色熒光；而以小鼠陰性血清為一抗時，所有病毒感染的細胞均無綠色熒光（圖3）。表明這3 株MAb 的特異性較強，與其他相關(guān)病毒均無交叉反應(yīng)性。

圖3 MAb與NDRV、CDRV和ARV交叉反應(yīng)性的IFA鑒定結(jié)果（200×）Fig.3 Identification of cross-reactivity of MAbs with NDRV,CDRV,and ARV by IFA

2.5 MAb 抗原表位的鑒定結(jié)果將人工合成的37條多肽分別包被ELISA 板后，再分別以3株MAb為一抗，經(jīng)間接ELISA 鑒定其識別的抗原表位。結(jié)果顯示，3株MAb 10-A5、A1-G9和B7-E5 及小鼠σB蛋白陽性血清均與SigB-4多肽呈陽性反應(yīng)，而與其余的多肽及小鼠陰性血清均呈陰性反應(yīng)（圖4A）。SigB-4多肽的氨基酸序列31LWDIEEFHTPDVIRV45即為MAb的抗原表位。將呈陽性反應(yīng)的SigB-4 多肽從N 端和C 端分別以2 個氨基酸為步移截短合成的8 條短多肽包被ELISA 板，再 分 別 以10-A5、A1-G9 和B7-E5 為 一抗，進一步經(jīng)ELISA 鑒定其識別的抗原表位。結(jié)果顯示，將SigB-4 多肽從N 端截短2 個氨基酸和從C 端截短2 個氨基酸后的短多肽（分別對應(yīng)SigB-4-1 和SigB-4-5）均與10-A5、A1-G9 和B7-E5 3 呈強陽性反應(yīng)。陽性對照與陰性對照與上述結(jié)果一致（圖4B）。表明，上述3 株MAb 識別的最小抗原表位的氨基酸序列均為33DIEEFHTPDVI43。

圖4 各肽段（A）及SigB-4各截短肽段（B）經(jīng)ELISA掃描鑒定MAb識別的抗原表位Fig.4 Epitopes recognized by MAbs were identified by ELISA scaning of overlapping peptides(A)and sigB-4 truncated peptides(B)

2.6 抗原表位的保守性分析參照NCBI 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列，利用BLAST 對已鑒定的線化抗原表位aa31～aa45 的保守性分析結(jié)果顯示，該抗原表位序列與不同地域和不同宿主來源的NDRV 和NGRV 分離株σB 蛋白對應(yīng)氨基酸序列的同源性均為100%；而與ARVs 其他成員CDRV、GRV、ARV 和TARV 不同分離株的相對應(yīng)蛋白氨基酸序列的同源性為53.3%～73.3%（表2，但數(shù)值未在該表中展示）。結(jié)果表明該抗原表位（aa33～aa43）在不同地域及不同來源的NDRV分離株中保守性很高，而在ARVs其他成員CDRV、GRV、ARV和TARV 中差異較大。

表2 3株MAb抗原表位保守性分析Table 2 Conservation analysis of antigenic epitopes of three MAbs

3 討 論

σB 是ARV 和DRV 主要的外衣殼蛋白，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生群特異性中和抗體[8-9]。對σB 蛋白抗原表位的精確定位為解析σB 介導(dǎo)的免疫保護機制，研發(fā)多肽表位疫苗及建立特異性檢測方法具有重要意義。MAb 是由單一B 細胞克隆產(chǎn)生的免疫球蛋白，具有特異性強、敏感性高、均質(zhì)性好、效價高等優(yōu)點，已成為研究抗原的結(jié)構(gòu)與功能、開發(fā)診斷試劑和抗原表位多肽疫苗的強有力工具[13-14]。由于NDRV 是水禽DRV新發(fā)的基因型，其σB 的MAb 及MAb 的抗原表位未被解析。為此，本研究制備了3 株鼠源抗NDRV σB蛋白的MAb（10-A5、A1-G9 和B7-E5），并對3 株MAb 的抗原表位進行了鑒定。

抗原表位又稱抗原決定簇，是引起宿主免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。可分為T 細胞抗原表位和B 細胞抗原表位。B 細胞表位是由抗原表面的親水性氨基酸組成，易接近B 細胞受體和抗體分子并被識別，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。為了探究NDRV σB 蛋白的B 細胞抗原表位，本研究利用B 細胞雜交瘤技術(shù)制備并獲得了3 株NDRV σB 蛋白的MAb，且鑒定了各MAb 的抗原表位。常用的抗原B 細胞表位鑒定方法主要有噬菌體展示肽技術(shù)、肽掃描技術(shù)以及生物信息學(xué)方法預(yù)測技術(shù)等[15]。本研究根據(jù)NDRV σB蛋白序列合成37 條長度為15 個氨基酸、且相互重疊5 個氨基酸的多肽，利用肽掃描技術(shù)結(jié)合ELISA 方法，篩選各MAb 的抗原表位。該方法相較于噬菌體展示肽技術(shù)更簡便、快速，但其缺點是僅能鑒定出線性抗原表位[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，ARV、CDRV 和TARV σB 蛋白的保守氨基酸序列主要位于N 端（aa1～aa113）[10,17]。對于ARV σB 蛋白，已鑒定出兩個抗原表位：21KTPACW26和32WDTVTFH38，位于σB 蛋白N 端aa21～aa38，且這兩個抗原表位為ARV 特異性B 細胞線性表位[10]；而對于CDRV σB 蛋白，也已鑒定出兩個抗原表位，即抗原表位A（65TDGVCFPHHK74）和表位B（19YIRAPACWD27），位 于σB 蛋 白N 端aa19～aa74，且 表 位B 是ARV 和CDRV 的群特異性表位，表位A 是CDRV 的特異性表位[17]。本研究鑒定出的NDRV σB 蛋白的最小抗原表位（33DIEEFHTPDVI43）也位于其N 端，但位點不同。對3 株MAb 識別抗原表位的保守性分析表明，該表位在不同基因型DRV（即CDRV 與NDRV）之間的保守性比較低（同源性小于54.5%），僅為NDRV的特異性表位。這一結(jié)果與不同基因型DRV 之間僅能與各自基因型的血清高度中和，而與異源血清僅有弱的交叉中和作用的結(jié)論一致[18]。因此，本研究制備的3 株MAb（10-A5、A1-G9 和B7-E5）均可作為鑒別檢測NDRV 和CDRV 感染的候選抗體。

NDRV 是目前中國流行鴨呼腸孤病毒病的主要基因型，至今還未有NDRV B 細胞抗原表位的相關(guān)報道，本研究首次通過制備針對NDRV σB 蛋白的MAb 對其抗原表位進行了鑒定，為NDRV 的型特異性檢測方法及其表位標記疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。