貯藏方法對紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌傳代能力的影響

劉暢，師尚禮，康文娟，苗陽陽，吳芳

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，黑龍江 大慶 163319)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上種植面積最廣的豆科牧草，由于其適應(yīng)性廣、產(chǎn)草量高、且富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)，被譽為“牧草之王”[1]。它與根瘤菌共生形成根瘤，能固定大氣中的氮，進而提高產(chǎn)量。紫花苜蓿與根瘤菌的結(jié)合方式既有外部侵染方式，也有內(nèi)生方式，既有共生促生方式，也有聯(lián)合促生方式，二者的結(jié)合方式與促生效應(yīng)或共生效應(yīng)關(guān)系密切，這是紫花苜蓿與根瘤菌共生育種的研究熱點。苜蓿根瘤菌以內(nèi)生菌形式存在時，可以合成化合物促進植物生長、提高植物對水分和營養(yǎng)的吸收、聯(lián)合固氮、提高植物的抗逆性[2]。根瘤菌內(nèi)生于紫花苜蓿種子，可運移并定殖于苜蓿根、莖、葉、種子等組織[3]，通過種子內(nèi)生根瘤菌傳代結(jié)瘤和固氮促生，這是共生系統(tǒng)可持續(xù)性的表現(xiàn)形式。苗陽陽[4]對苜蓿添加適宜濃度的外源物質(zhì)如硼、赤霉素、苦參堿并接種熒光標記根瘤菌株，可以促使根瘤菌侵染昔蓿根系進入其內(nèi)部，在苜蓿植株體內(nèi)運移并定殖，最后運移到成熟種子中。種子內(nèi)生菌可以協(xié)助寄主植物抗菌[5]，提高植物抗旱能力[6]。種子內(nèi)生根瘤菌能否傳代至次代植株并結(jié)瘤固氮，對于種子內(nèi)生根瘤菌的有效利用和在植物代際間的功能延續(xù)具有重要意義。

研究表明植物內(nèi)生微生物也可垂直傳代[7]，Adam等[8]研究發(fā)現(xiàn)南瓜(Cucurbitamoschata)種子內(nèi)生微生物可以垂直傳播到下一代植物。Liu等[10]報道了在水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)中特定的內(nèi)生菌可以進行多代傳代，Johnston-Monje等[11]使用綠色熒光蛋白對內(nèi)生菌進行標記，證明了內(nèi)生菌是從玉米種子進入根和根際土壤，再運移到植物的其他組織，趙霞[12]對水稻種子內(nèi)生細菌來源測定發(fā)現(xiàn)水稻植株內(nèi)生菌存在代際間傳代。

紫花苜蓿的主要繁殖方式為種子繁殖，種子質(zhì)量直接影響到牧草產(chǎn)量[13]，溫度、濕度是影響種子質(zhì)量的關(guān)鍵因素，也影響著種子內(nèi)生菌的數(shù)量及生命力[14]。李春杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏溫度的升高，苜蓿種子攜帶真菌檢出率逐漸增高，張遠兵等[16]發(fā)現(xiàn)冰箱內(nèi)濕藏后的牡丹(Paeoniasuffruticosa)種子萌發(fā)率最高，孔祥輝等[17]發(fā)現(xiàn)韭菜(Alliumtuberosum)種子經(jīng)過硅膠干燥處理后可以延長貯藏壽命。苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌在不同溫度及水分條件下，是否可以保存活性并傳代，目前鮮見報道。因此，本研究以不同貯藏方式的內(nèi)生青色熒光蛋白(GFP)標記根瘤菌的紫花苜蓿種子為試驗材料，通過對內(nèi)生根瘤菌種子次代植株體內(nèi)GFP根瘤菌分布和定殖數(shù)量研究，明確苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌傳代能力和結(jié)瘤有效性，并篩選出有利于提高種子內(nèi)生根瘤菌傳代能力和傳代有效性的最佳貯藏方法，為揭示優(yōu)良根瘤菌在苜蓿種子代際間的延續(xù)提供依據(jù)，也為紫花苜蓿-根瘤菌共生育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

種子來源：苗陽陽[4]于2014年在草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室牧草實訓(xùn)基地生長4 a的甘農(nóng)5號紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.5)，通過結(jié)莢期以根部直接澆灌的接種方法接種青色熒光蛋白(GFP)標記的根瘤菌株EnsifermelilotiLZgn5f(gn5f)和根瘤菌株Ensifer.meliloti12531f(12531f)獲得兩種內(nèi)生根瘤菌種子，室內(nèi)風(fēng)干兩個月后進行貯藏[18]。以無菌水澆灌苜蓿植株后收獲的種子為對照。

gn5f的原始菌株E.melilotiLZgn5分離自甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子的內(nèi)源根瘤菌，為快生型產(chǎn)酸根瘤菌；12531f原始菌株E.meliloti12531購自中國科學(xué)院微生物保藏中心—分離自非本苜蓿植株體內(nèi)的外源根瘤菌，為慢生型產(chǎn)堿中華根瘤菌，通過三親本雜交法構(gòu)建熒光標記根瘤菌。

培養(yǎng)基：YMA剛果紅培養(yǎng)基(1 L)：0.5 g K2HPO4·3H2O，0.2 g MaSO4·7H2O，0.1 g NaCl，10 g甘露醇，1 g酵母粉，10 mL 0.25 g/100 mL剛果紅溶液，1 000 mL蒸餾水，pH值7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L。

營養(yǎng)液：Hoagland有氮營養(yǎng)液和Hoagland無氮營養(yǎng)液，以1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)營養(yǎng)液 pH值=7.0±0.1。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子貯藏 將分別含gn5f和12531f的甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子和對照種子于2014年11月-2017年11月進行預(yù)處理，具體方法為：采用信封包裝，25 ℃+自然濕度(相對濕度為45%—65%)(S1)、25 ℃+硅膠干燥(每一個月更換一次硅膠)(S2)、4 ℃+冰箱冷藏濕度(S3)和-4 ℃+冰箱冷凍濕度(S4)下貯藏[18]。

1.2.2 苜蓿幼苗培養(yǎng) 在草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室沙培法栽培苜蓿幼苗[19]。嚴格控制生長條件與試驗條件，區(qū)組內(nèi)差異視為試驗誤差。分別選取貯藏后健康飽滿、大小一致的紫花苜蓿gn5f內(nèi)生種子、12531f內(nèi)生種子和對照種子，在無菌操作臺內(nèi)碘伏消毒2 min并用無菌水清洗4次后用無菌濾紙吸干水分。蛭石、細沙洗凈烘干，滅菌(121 ℃，滅菌26 min)3次后，蛭石∶細沙=1∶1裝入直徑30 cm、高30 cm、容積21 L的花盆內(nèi)，花盆栽入土中20 cm深。每盆播種50粒已消毒的種子，表面覆蓋干沙2 cm左右。每花盆內(nèi)加Hoagland有氮營養(yǎng)液1次，發(fā)芽前澆無菌水補充水分。發(fā)芽后每15天澆Hoagland無氮營養(yǎng)液1次，期間澆無菌水補充水分，45 d收獲苜蓿植株(植株相對高度約18 cm)。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 苜蓿植株體內(nèi)熒光標記根瘤菌的檢測 每處理每個重復(fù)隨機取3株幼苗，根、莖、葉分離，分別稱取1 g置于無菌三角瓶中，在超凈工作臺內(nèi)用醫(yī)用碘伏浸沒各部分震蕩消毒2 min后，用無菌水沖洗，直至沖洗液澄清透明無泡沫。將表面消毒的植物組織在固體培養(yǎng)基上放置30 min后取出，培養(yǎng)基置于28 ℃下培養(yǎng)48 h，未長出菌落表明植物組織表面已徹底消毒[20]，將消毒后的各個組織放到無菌研缽中，加無菌水2 mL，充分研磨后，將研磨液倒入5 mL無菌離心管中，4 000 r/min，離心5 min，吸取0.2 mL上清液涂布于含剛果紅的YMA固體培養(yǎng)基中(根部吸取上清液后，用無菌水配置成10-1、10-2、10-3稀釋液)，28 ℃培養(yǎng)48 h[21]。培養(yǎng)結(jié)束后，黑暗條件下用手提式紫外燈(波長336 nm)觀察并記錄發(fā)青色的熒光標記根瘤菌落數(shù)，換算出每克植物組織中熒光標記根瘤菌數(shù)量[22]。

1.3.2 結(jié)瘤能力檢測 每處理每個重復(fù)隨機取10株幼苗(根系完整)，蒸餾水沖洗根系周圍細沙、蛭石，無菌濾紙吸干水分。

(1)測定苜蓿幼苗的單株結(jié)瘤數(shù)；(2)測定苜蓿幼苗的單株有效根瘤重，使用滅菌的手術(shù)刀，將每株幼苗的所有根瘤沿根瘤與根系連接處切下，放在濾紙上吸干表面水分后稱重[23]；(3)苜蓿幼苗的根瘤直徑測量：游標卡尺；(4)根瘤等級：根瘤等級劃分參考5分制計分法[24]：1分：中空無內(nèi)容物的死亡根瘤；2分：橫切面呈灰白色的無效根瘤；3分：直徑小于0.5 mm的粉色根瘤；4分：直徑0.5～1 mm的粉色根瘤；5分：直徑大于1 mm的粉色根瘤；(5)固氮酶活性：采用乙炔還原法[25]。切下根瘤，稱取鮮重，放置8 mL青霉素瓶中，蓋緊瓶塞并密封，使用微量注射器抽取0.8 mL空氣，并注入0.8 mL乙炔氣體，反應(yīng)2 h。然后使用100 μL微量注射器吸取50 μL瓶內(nèi)氣體注入氣象色譜儀[26]。

C2H4水平(μmol/(g·h))=

C：標準C2H4濃度(nmol/mL)；hx：樣品峰面積；V：反應(yīng)氣體體積(mL)；hs：標準C2H4峰面積22.4(乙烯的物質(zhì)的量)；t：反應(yīng)時間(h)；m：瘤重(g)。

1.3.3 生長指標 每處理每個重復(fù)隨機取4株幼苗(根系完整)，蒸餾水沖洗根系周圍細沙、蛭石，無菌濾紙吸干水分，測定生長指標。

(1)單株葉片數(shù)(復(fù)葉)；(2)株高、根長測量：直尺；(3)地上生物量：天平稱取地上鮮重；然后放于烘箱中105 ℃烘20 min，隨后80 ℃烘至恒重，稱其干重；(4)地下生物量：同(3)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0進行方差分析，Duncan法多重比較，利用R語言做相關(guān)性分析，EXCEL 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏方法對苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌傳代定殖的影響

不同貯藏處理下，次代植株各組織部位中可不同程度檢測到gn5f、12531f根瘤菌。苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌可傳代至次代植株中(圖1)。

gn5f在S1、S3、S4貯藏處理的植株根部可檢測到，且S1貯藏處理較S3、S4貯藏處理根瘤菌數(shù)量分別增加了308.88%和78.07%(P<0.05)，而S2貯藏處理未檢測到(圖1-A)。12531f在S1、S2、S4貯藏處理的植株根部可檢測到，且S2處理根部定殖數(shù)量最大，為560.63 cfu/g，顯著高于S1和S4(P<0.05)，分別提高了117.23%，284.60%；S3貯藏處理根部未檢測到12531f。CK處理根部均未檢測到gn5f和12531f(圖1-A)。

次代植株莖部標記根瘤菌定殖情況為，gn5f在S1、S3、S4貯藏處理植株莖部可檢測到，S1貯藏處理莖部定殖數(shù)量最多，為303.03 cfu/g，分別高于S3、S4貯藏處理117.11%和36.00%(P<0.05)。12531f在S1、S4貯藏處理植株莖部檢測到，S1貯藏處理的定殖數(shù)量最大，為36.13 cfu/g，高于S4294.33%(P<0.05)。標記根瘤菌gn5f、12531f在CK和S2貯藏處理植株莖部未檢測到(圖1-B)。

次代植株葉部標記根瘤菌定殖情況為gn5f在S1、S2貯藏處理植株葉部可檢測到，S1貯藏處理葉部定殖數(shù)量最大，為11.10 cfu/g，顯著高于S2貯藏處理127.46%(P<0.05)。12531f在S2、S3、S4貯藏處理植株葉部可檢測到，S4貯藏處理12531f定殖數(shù)量最多，為25.27 cfu/g，較S2、S3貯藏處理分析增加了17.97%和410.50%(P<0.05)，但S1貯藏處理未檢測到。gn5f、12531f在CK葉部均未檢測到(圖1-C)。

圖1 不同貯藏方法下苜蓿內(nèi)生熒光標記菌株gn5f、12531f在次代植株根、莖、葉內(nèi)的定殖數(shù)量

根據(jù)以上分析，gn5f在S1處理各部位數(shù)量均最高，12531f在S2處理根部數(shù)量最高，兩個菌株在次代植株中的內(nèi)生部位和定殖數(shù)量受到種子貯藏條件的影響。在各貯藏處理下，次代植株兩個菌株內(nèi)生部位從根、莖到葉，根瘤菌數(shù)量均呈遞減趨勢，且根部>>莖部>>葉部。

2.2 貯藏方法對次代植株結(jié)瘤有效性的影響

各貯藏處理下，不同程度增加gn5f、12531f在次代植株上的結(jié)瘤能力(圖2)。S1貯藏處理次代gn5f單株結(jié)瘤數(shù)最高，為12.33個，較CK高37%。S3貯藏處理單株結(jié)瘤數(shù)為8.67個，較CK高8.38%。S2、S4貯藏處理單株結(jié)瘤數(shù)分別為6.33個和6個，較CK分別減少了34.52%、27.97%(P<0.05)。S2處理12531f單株結(jié)瘤數(shù)最高，為13.33個，較CK高37.90%(P<0.05)。S1、S4貯藏處理單株結(jié)瘤數(shù)分別為7個和5個，較CK分別減少了22.22%、39.98%；S3貯藏處理單株結(jié)瘤數(shù)為10.67個，高于CK 33.38%(P<0.05)(圖2-A)。

S1貯藏處理gn5f單株有效根瘤重最高，為0.101 4 g，較CK增加了1 183.54%(P<0.05)。S2貯藏處理單株有效根瘤重為0.016 9 g，較CK減少了3.98%。S3、S4貯藏處理單株有效根瘤重分別為0.0376 g和0.0145 g，較CK分別增加了353.01%、62.92%(P<0.05)。S3貯藏處理12531f單株有效根瘤重最大，為0.028 g，較CK增加了237.35%(P<0.05)。S1、S2貯藏處理單株有效根瘤重分別為0.014 5 g和0.022 0 g，分別高于CK83.54%、25%(圖2-B)。

4個貯藏處理下，gn5f、12531f根瘤直徑均高于CK。gn5f、12531f均在S2貯藏處理根瘤直徑最高，分別為2.16 mm和1.82 mm，較CK分別增加了44.00%和21.33%(P<0.05)(圖2-C)。

S1貯藏處理gn5f根瘤等級最高，為5，顯著高于CK和同菌株其他貯藏處理(P<0.05)。S2貯藏處理根瘤等級為3，較CK減少了25.00%。S2貯藏處理12531f根瘤等級最大，為5，較CK增加了25.00%(P<0.05)；S1貯藏處理根瘤等級為4，高于CK 33.33%；S4貯藏處理根瘤等級為2，較CK減少了33.33%(P<0.005)(圖2-D)。

S1貯藏處理gn5f固氮酶活性最強，為60.46 μmol/(g·h)，顯著高于CK(P<0.05)。S3、S4處理固氮酶活性有不同程度提升，且S2貯藏處理12531f固氮酶活性最強，為126.44 μmol/(g·h)。S1、S4貯藏處理固氮酶活性為0.034 3 μmol/(g·h)、0.162 1 μmol/(g·h)，較CK分別減少了86.38%、44.68%；S3貯藏處理固氮酶活性為81.67 μmol/(g·h)(P<0.05)(圖2-E)。

圖2 不同貯藏方法下內(nèi)生gn5f、12531f種子的次代苜蓿幼苗單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、根瘤直徑、根瘤等級、固氮酶活性

2.3 不同貯藏方法種子內(nèi)生根瘤菌對次代植株生長的促進效應(yīng)

S1、S3貯藏處理次代植株gn5f單株葉片數(shù)分別為14.33和11.00，分別高于CK 38.72%、17.90%(P<0.05)。S2、S4貯藏處理單株葉片數(shù)和CK一樣，分別為11.33和9.67。S2、S3貯藏處理12531f單株葉片數(shù)分別為16.00和11.67，分別高于CK 41.22%、25.08%(P<0.05)。S1、S4貯藏處理單株葉片數(shù)為11.33和11，分別高于CK 9.67%、13.75%(圖3-A)。

4個貯藏處理下，次代植株的株高均高于CK。gn5f在S1貯藏處理株高最大，為19.52 cm，較CK增加了40.63%(P<0.05)。12531f在S2貯藏處理株高最大，為19.85 cm，較CK增加39.40%(P<0.05)(圖3-B)。

4個貯藏處理下，次代植株根長均高于CK。gn5f在S1貯藏處理根長最高，為15.43 cm(P<0.05)，較CK增加了33.82%(P<0.05)。12531f在S2貯藏處理根長最大，為17.23 cm，較CK增加36.04%(P<0.05)(圖3-C)。

圖3 在不同貯藏方法下內(nèi)生gn5f、12531f種子的次代苜蓿幼苗單株葉片數(shù)、株高、根長

內(nèi)生根瘤菌對次代植株苗期的生物量積累有不同程度的促進作用，S1貯藏處理次代植株gn5f地上鮮重最高，為0.4934 g，較CK高68.11%(P<0.05)。S2貯藏處理地上鮮重為0.2871 g，較CK減少了3.63%；S3、S4貯藏處理地上鮮重分別為0.3612 g、0.2837g，較CK分別高39.89%、9.71%。4種貯藏處理下12531f地上鮮重均高于CK，在S2貯藏處理地上鮮重最高，為0.5135 g，較CK提高了72.37%(P<0.05)(表1)。

表1 不同貯藏方法下次代植株苗期的生物量

4個貯藏處理下，次代植株地上干重均高于CK。gn5f在S1貯藏處理地上干重最高，為0.1405 g，較CK增加了137.73%(P<0.05)。12531f在S2貯藏處理下地上干重最高，為0.1399 g，較CK增加了144.58%(P<0.05)。

4個貯藏處理下，次代植株根鮮重均高于CK。gn5f在S1貯藏處理根鮮重最高，為0.4179 g，較CK增加了223.70%(P<0.05)。12531f在S2貯藏處理根鮮重最高，為0.3587 g，較CK增加了284.05%(P<0.05)。

4種貯藏處理下gn5f根干重均高于CK，在S1貯藏處理根干重最高，為0.1036 g，較CK增加了600.00%(P<0.05)。S2、S3、S4貯藏處理根干重分別為0.0276 g、0.0321 g、0.0194 g，較CK分別增加了196.77%、221.00%、162.16%。12531f在S2貯藏處理根干重最高，為0.090 4 g，較CK增加了872.04%(P<0.05)。

2.4 次代植株傳代根瘤菌結(jié)瘤有效性與生長效應(yīng)的相關(guān)性分析

對不同貯藏處理下的次代植株根系結(jié)瘤有效性、生長效應(yīng)進行相關(guān)性分析表明，單株結(jié)瘤數(shù)與根瘤等級、固氮酶活性、單株葉片數(shù)、株高、根長均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)達到70%以上，與地上鮮重、地上干重呈正相關(guān)(P<0.05)；根瘤等級和固氮酶活性都與單株葉片數(shù)、株高、根長、地上干重呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(圖4)。單株葉片數(shù)和根長與單株有效根瘤重、根瘤直徑不相關(guān)外，與其他9個指標間亦呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)達到75%以上。株高與根瘤直徑不相關(guān)外，與單株有效根瘤重呈正相關(guān)(P<0.05)，與其他9個指標間亦呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；地上鮮重與單株葉片數(shù)、株高、根長、地上干重、根鮮重、根干重呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)達到80%以上(圖4)。根瘤直徑與其他11個指標之間的相關(guān)性較低。

圖4 貯藏方法對次代植株苗期根系結(jié)瘤能力、幼苗生長能力的相關(guān)性分析

3 討論

內(nèi)生根瘤菌是能與宿主植物互利共生的有益細菌，可以合成化合物促進植物生長、提高植物對水分和營養(yǎng)的吸收、聯(lián)合固氮、提高植物的抗逆性[27]。種子是下一代植株內(nèi)生根瘤菌的重要來源，但是種子內(nèi)生根瘤菌的來源并不明確。而在本研究中，將具有熒光標記根瘤菌的種子作為試驗材料，有利于更深入地研究內(nèi)生根瘤菌的傳代能力和傳代有效性，同時避免了其他來源內(nèi)生根瘤菌的干擾。此外，本研究采用不同貯藏方法的內(nèi)生根瘤菌種子，可篩選出適宜優(yōu)良苜蓿-根瘤菌共生體的貯藏條件。

本研究在次代植株苗期的各部位均可檢測到gn5f、12531f，說明種子內(nèi)生根瘤菌可以傳代至次代植株中。張彩文[28]在研究中發(fā)現(xiàn)，水稻親代種子內(nèi)生菌可在植株生長發(fā)育過程中傳播到根、莖組織并最終傳播到子代種子內(nèi)，即種子內(nèi)生菌可以進行垂直傳播，與本試驗結(jié)果一致。張淑卿[29]標記菌遷移試驗發(fā)現(xiàn)的根瘤菌自根向莖頂部的運移通道是存在的，標記根瘤菌在運移通道中的分布是不連續(xù)的，在部分通道組織內(nèi)能只能選擇性允許標記菌通過，不能長期定殖。本試驗中不同貯藏條件的種子內(nèi)生根瘤菌雖均可以傳代至次代植株中，但兩種菌株在根部定殖數(shù)量高于莖、葉部，且gn5f在S1貯藏處理根、莖、葉部定殖數(shù)量顯著高于其他貯藏處理；12531f在S2貯藏處理根部定殖數(shù)量顯著高于其他貯藏處理，個別貯藏條件下的次代植株苗期根、莖、葉部未檢測到標記根瘤菌，可能是莖、葉部位標記根瘤菌測定不表現(xiàn)，這都證實了其研究結(jié)果。

gn5f和12531f在次代植株苗期的定殖數(shù)量有差異，gn5f在S1貯藏條件次代植株中的數(shù)量最多，12531f在S2貯藏條件次代植株中的數(shù)量最多?？赡苁怯捎趦煞N菌株來源不同，對于甘農(nóng)5號紫花苜蓿來說，gn5f原始菌株gn5為內(nèi)源菌株，是快生型根瘤菌，12531f原始菌株12531為外源菌株，是慢生型根瘤菌，兩種菌株的遺傳性狀差異較大；其次可能是種子貯藏方法不同導(dǎo)致內(nèi)生根瘤菌在次代植株傳代能力不同。溫度影響細菌的生理生化代謝途徑，Hoch等[30]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度低于12 ℃時，微生物的生長速率與溫度成正相關(guān)，在適宜溫度下，細菌繁殖快，更容易存活，溫度過低后微生物生長出現(xiàn)逆境，表現(xiàn)為微生物數(shù)量較低等，祁娟[31]的研究表明在-16～20 ℃苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌存在著低溫臨界點，低于此溫度臨界點，苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌生長會受阻，本試驗也證實了這一點。適宜的貯藏溫度內(nèi)生根瘤菌適合存活可以順利傳代，而低溫對微生物生長的抑制作用較大，從而導(dǎo)致-5 ℃下內(nèi)生根瘤菌數(shù)量較少[32]。適宜的溫度下微生物才能生長繁殖，過高或過低的溫度均不利于微生物的生長和繁殖，這就可能造成不同溫度貯藏下的次代植株苗期內(nèi)生根瘤菌數(shù)量差異較大。

不適宜的貯藏溫度可能會導(dǎo)致種子中的內(nèi)生菌致死[33]，在種子貯存過程中，內(nèi)生菌的活性的降低先于種子活力的降低[34]，與種子的活力相比，內(nèi)生菌的活性更容易受溫度、濕度等外部條件的影響，其活力比種子活力低[35-36]。苗陽陽[18]在研究25 ℃、25 ℃硅膠干燥、-4 ℃和4 ℃貯藏方法下次代種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量時，其數(shù)量和本試驗中次代植株內(nèi)生根瘤菌數(shù)量有差異，或因內(nèi)生根瘤菌在苜蓿種子中的定殖數(shù)量可能會隨著貯藏時間及條件的變化而降低，也可能是因為內(nèi)生根瘤菌存在于種子中但是未表現(xiàn)出來或在貯藏過程中次代種子內(nèi)生根瘤菌進行再一次的增殖或衰減。

接種根瘤菌可有效促進紫花苜蓿早結(jié)瘤，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)[37]，本試驗內(nèi)生根瘤菌種子的次代植株結(jié)瘤競爭能力高于CK，兩個內(nèi)生根瘤菌菌株均可提高次代植株苗期的結(jié)瘤有效性和生長效應(yīng)，任安芝等[38]也證明種子內(nèi)生菌可以有效提高幼苗根長和苗高、生物量積累等，祁娟[31]將苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌分離純化后回接的試管苗的結(jié)瘤指標、生物量均得到提高。本試驗表明不同貯藏方法的種子內(nèi)生根瘤菌可以高效傳代，根瘤菌傳代后依然可以增加苜蓿植株生物量。但內(nèi)生根瘤菌能否在苜蓿植株生殖生長期穩(wěn)定生存，并保持良好的促生效果，是否可以繼續(xù)傳代至第三代種子中有待繼續(xù)研究。

4 結(jié)論

適宜的貯藏方法有利于提高種子內(nèi)生根瘤菌的傳代能力和傳代有效性，在4種貯藏條件下，苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌均可傳代至次代植株苗期各部位，gn5f內(nèi)生種子適宜S1貯藏，可高效傳代到次代植株共生結(jié)瘤，固氮促生；12531f內(nèi)生種子適宜S2貯藏，可高效傳代到次代植株共生結(jié)瘤，固氮促生。在各貯藏條件下，均可不同程度提高gn5f、12531f次代植株苗期的單株葉片數(shù)、株高、根長、生物量；gn5f內(nèi)生種子在S1貯藏，可提高次代植株苗期的單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、根瘤直徑、根瘤等級；12531f內(nèi)生種子在S2貯藏，可提高種子植株苗期的單株結(jié)瘤數(shù)、單株根瘤重、根瘤直徑、根瘤等級、固氮酶活性；兩種菌株穩(wěn)定傳代到下一代植株時均有向繁殖器官運移定殖的明顯趨勢。