烏梅總黃酮對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用*

王春玲，羅 寧，文曉東△，蔣媛靜，劉 鈺，馮文勇

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530011)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見(jiàn)于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其特征性病理改變是黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性死亡。迄今為止，PD中黑質(zhì)DA神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因尚不完全清楚，目前研究認(rèn)為腦細(xì)胞線粒體損傷及其功能障礙是導(dǎo)致PD發(fā)病的機(jī)制之一[1-2]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為體內(nèi)能量平衡的主要傳感器，對(duì)于調(diào)控應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的正常代謝至關(guān)重要，鈣調(diào)蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2，CaMKKβ)作為AMPK上游因子，可以通過(guò)其磷酸化來(lái)激活A(yù)MPK。CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、保護(hù)線粒體功能、對(duì)抗氧化應(yīng)激等生理過(guò)程[3-4]。研究表明，CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)各種與PD相關(guān)的蛋白，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在PD發(fā)病機(jī)制及神經(jīng)元保護(hù)中發(fā)揮著重要作用[5]。此外，有證據(jù)顯示，線粒體是CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要細(xì)胞器，AMPK通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)線粒體功能參與神經(jīng)元的不同階段調(diào)控[6-7]。

烏梅(Fructus Mume)為薔薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc．的干燥近成熟果實(shí)，為治療PD的常用中藥及配伍用藥，烏梅總黃酮(Fructus Mume total flavone，F(xiàn)MF)為烏梅提取的有效成分，具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗炎等藥理作用[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MF具有保護(hù)PD模型大鼠神經(jīng)元的作用，可以減輕6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)引起的線粒體功能損傷[9]，但是其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-inethyl-4-phenylpyridinium，MPP+)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型，采用不同濃度的FMF干預(yù)，探討FMF體外實(shí)驗(yàn)中的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用烏梅和開(kāi)發(fā)FMF新型防治PD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株

SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔?/p>

1.1.2藥品及試劑

純度95%的FMF對(duì)照品(西安賽奧生物科技有限公司，批號(hào)：20210714)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Sigma 公司)；線粒體膜電位(ΔΨm)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；CCK-8試劑盒(美國(guó)Abcam公司)。兔抗CaMKKβ一抗、兔抗AMPK一抗、兔抗磷酸化CaMKKβ(p-CaMKKβ)一抗、兔抗磷酸化AMPK(p-AMPK)一抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)。

1.1.3儀器

超凈工作臺(tái)(江蘇省蘇州空氣凈化設(shè)備公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；IX51型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)培養(yǎng)，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中。隔天換液，每2～3天以1∶3傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞模型的構(gòu)建及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1×105/mL，接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，加入不同終濃度MPP+溶液(0、125、250、500、1 000、2 000 μmol/L)，分別處理 16、24、48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。以0 μmol/L MPP+為對(duì)照組，細(xì)胞活性及細(xì)胞數(shù)量明顯下降，最終確定250 μmol/L終濃度的MPP+作用24 h，建立PD的細(xì)胞模型。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組(只加SH-SY5Y細(xì)胞，不加藥物)、模型組(250 μmol/L MPP+)、FMF低劑量組(250 μmol/L MPP++10 μmol/L FMF)、中劑量組(250 μmol/L MPP++50 μmol/L FMF)和高劑量組(250 μmol/L MPP++100 μmol/L FMF)。FMF各劑量組用不同終濃度的FMF(10、50、100 μmol/L)預(yù)處理 24 h后，然后再加入250 μmol/L終濃度的MPP+繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞分組及處理同1.2.2。待細(xì)胞貼壁后，按照分組給予不同處理，至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，加入CCK-8工作液(每孔10 μL)，混勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，3 h后在全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處各孔吸光度(A490)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取其均值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值×100%。

1.2.4ΔΨm檢測(cè)

細(xì)胞分組及處理同1.2.2。各組細(xì)胞處理結(jié)束后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入JC-1染色工作液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，孵育結(jié)束后除去染色溶液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ΔΨm。

1.2.5Western blot檢測(cè)CaMKKβ、AMPK表達(dá)及其磷酸化水平

細(xì)胞分組及處理同1.2.2。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白水平，取30 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min，分別加入稀釋好的一抗：CaMKKβ(1∶500)、AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、p-CaMKKβ(1∶1 000)一抗抗體和GADPH抗體(內(nèi)參，1∶2 000)孵育，4 ℃過(guò)夜TBST洗3次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記與一抗同源的二抗IgG(1∶2 000)室溫50 min，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液中反應(yīng)1 min，采用Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 FMF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

模型組SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低至(53.00±6.16)%，與對(duì)照組(100%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MPP+處理前分別給予不同濃度的FMF干預(yù)后，細(xì)胞存活率明顯提高，F(xiàn)MF低、中、高劑量組細(xì)胞存活率分別為(62.67±8.36)%、(72.00±6.33)%、(86.67±6.65)%，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2 FMF對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ΔΨm的影響

與對(duì)照組[(20.54±3.23)%]比較，模型組細(xì)胞ΔΨm[(1.92±0.63)%]明顯下降(P<0.001)。與模型組相比，F(xiàn)MF低、中、高劑量組細(xì)胞ΔΨm均上升，分別為(6.68±0.83)%、(9.76±1.92)%、(16.77±3.47)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：FMF高劑量組；D：FMF中劑量組；E：FMF低劑量組。

2.3 FMF對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞CaMKKβ、AMPK表達(dá)及其磷酸化水平的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞p-CaMKKβ、p-AMPK表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)MF低、中、高劑量組p-CaMKKβ表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01或P<0.05)，F(xiàn)MF低、中、高劑量均能上調(diào)p-AMPK表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。經(jīng)FMF低、中、高劑量處理后，細(xì)胞內(nèi)的CaMKKβ、AMPK表達(dá)水平與模型組細(xì)胞比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1 、圖2。

表1 FMF對(duì)PD體外細(xì)胞模型中CaMKKβ、AMPK表達(dá)及磷酸化水平的影響

1：對(duì)照組；2：模型組；3：FMF低劑量組；4：FMF中劑量組；5：FMF高劑量組。

3 討 論

越來(lái)越多的研究表明，線粒體功能損害及其引發(fā)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10-11]。因此，將線粒體作為PD治療的靶點(diǎn)，改善線粒體功能障礙，減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷，降低DA能神經(jīng)元死亡成為防治PD的重要策略[12]。

FMF是從中藥烏梅中提取的主要有效成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗炎、抗病毒等藥理作用[13-14]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MF能下調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)水平，升高Bcl-2/Bax比值，抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。但是FMF的神經(jīng)保護(hù)作用是否與靶向線粒體、拮抗線粒體氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，以及其具體作用機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外還少有相關(guān)研究報(bào)道。 MPP+是一種神經(jīng)毒劑，通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)進(jìn)入細(xì)胞后損傷線粒體功能，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元損傷；SH-SY5Y細(xì)胞的生理功能、細(xì)胞形態(tài)與正常的神經(jīng)細(xì)胞相似，MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立的PD體外模型已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致公認(rèn)，并被廣泛用于PD的實(shí)驗(yàn)研究[15]。因此，本研究采用MPP+誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞建立PD的體外模型。

本研究采用MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，確定最佳建模濃度及時(shí)間為MPP+250 μmol/L處理24 h，并用于研究FMF對(duì)PD體外細(xì)胞模型的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。結(jié)果表明，在MPP+刺激SH-SY5Y細(xì)胞前24 h，給予10、50、100 μmol/L FMF可抑制MPP+作用所產(chǎn)生的細(xì)胞存活率下降，且改變與藥物呈劑量依賴關(guān)系，以100 μmol/L FMF保護(hù)作用最明顯，提示在一定濃度范圍內(nèi)FMF對(duì)MPP+誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)FMF對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有明顯的干預(yù)作用[16]，因此該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以前的報(bào)道一致。

ΔΨm是穩(wěn)定線粒體膜完整性，維持線粒體正常功能的關(guān)鍵因素[17]。當(dāng)ΔΨm降低時(shí)，引起線粒體膜通透性改變，影響線粒體呼吸鏈，使體內(nèi)氧自由基生成增加，進(jìn)一步加重線粒體損傷，引起神經(jīng)細(xì)胞功能障礙甚至死亡；此外，受損的線粒體釋放細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)和凋亡誘導(dǎo)因子，造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)觀察了FMF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能的影響。JC-1染色是檢測(cè)ΔΨm的常用方法[19]。JC-1檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞ΔΨm下降，F(xiàn)MF干預(yù)抑制了ΔΨm的下降，隨著FMF濃度增加，ΔΨm逐漸上升，提示在一定濃度范圍內(nèi)FMF可部分恢復(fù)MPP+損傷SH-SY5Y 細(xì)胞的ΔΨm，具有保護(hù)線粒體膜功能的作用。

有研究表明，CaMKKβ、AMPK是與PD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的蛋白[6，20]。AMPK是細(xì)胞重要的能量感受器和調(diào)節(jié)器，是能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[21]。有研究顯示，在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠和MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞中，AMPK磷酸化受到抑制，應(yīng)用AMPK的藥理抑制劑Compound C抑制AMPK的表達(dá)可增加MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[22-23]。AMPK受CaMKKβ調(diào)節(jié)，CaMKKβ是一種激活鈣調(diào)素依賴蛋白激酶的激酶，是AMPK的主要上游蛋白激酶，可以激活A(yù)MPK，其作用位點(diǎn)是AMPK α亞基Thr172[24]。有研究證實(shí)在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型腦黑質(zhì)中CaMKKβ表達(dá)明顯下調(diào)[25]。近年研究顯示，線粒體是CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞靶器官，AMPK通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)線粒體功能參與神經(jīng)元的不同階段調(diào)控[26-27]。p-CaMKKβ、p-AMPK是CaMKKβ、AMPK的活化狀態(tài)，是CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路活化的標(biāo)志[28]。本研究中，MPP+明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞CaMKKβ、AMPK磷酸化水平，而FMF處理后可以明顯提高CaMKKβ、AMPK的磷酸化水平。基于這些結(jié)果，認(rèn)為FMF可能通過(guò)激活CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，F(xiàn)MF可明顯減輕MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，抑制線粒體功能障礙。其潛在的作用機(jī)制可能是FMF能夠調(diào)節(jié)CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路，緩解線粒體損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路可能成為治療PD的有效靶點(diǎn)，而FMF如何啟動(dòng)CaMKKβ/AMPK信號(hào)通路，需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)完善研究。