拉曼光譜技術(shù)在血脂異常診斷試驗(yàn)中的應(yīng)用*

謝景麗，曾麒霖 綜述，姜文錫 審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

血脂異常通常指由于脂質(zhì)代謝紊亂而引起血清中血脂成分含量的異常變化，又稱高脂血癥[1]。高脂血癥促進(jìn)脂質(zhì)在血管內(nèi)皮下沉積而形成斑塊，晚期斑塊破裂形成血栓，堵塞冠狀動(dòng)脈或腦血管造成心肌梗死或腦卒中[2]，是心腦血管疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。目前，中國(guó)成人高脂血癥患病率高達(dá)40.4%，隨著人群血脂水平的升高，我國(guó)心血管病事件在2010—2030年預(yù)計(jì)增加920萬(wàn)[3]，所以提高血脂異常的早期檢出率、控制血脂水平對(duì)減少心血管病事件的發(fā)生至關(guān)重要。

拉曼光譜基于分子振動(dòng)產(chǎn)生，可以反映分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從分子水平反映組織病理變化，是一種基于分子水平的檢測(cè)手段[4]。疾病的發(fā)生與分子蛋白質(zhì)、脂類、核酸、糖等各種成分的改變相關(guān)，而光譜技術(shù)是了解這些物質(zhì)變化最靈敏的技術(shù)[5]。通過(guò)激光散射獲得拉曼光譜圖譜，根據(jù)波峰的位置、強(qiáng)度、譜線的寬度，可獲得這些大分子物質(zhì)的含量及結(jié)構(gòu)信息[6]。拉曼光譜技術(shù)可以探尋血清中與疾病相關(guān)的大分子物質(zhì)的譜線特征，從分子水平研究與疾病相關(guān)的物質(zhì)在血清中的濃度變化，從而進(jìn)行疾病的診斷。

大多數(shù)高脂血癥患者無(wú)任何癥狀和異常體征表現(xiàn),常常是在進(jìn)行血液生化檢驗(yàn)時(shí)被發(fā)現(xiàn)[7]，這并不利于血脂異常的早期發(fā)現(xiàn)，而且現(xiàn)有的診斷方法主要靠血常規(guī)檢測(cè)，此方法雖然普及且簡(jiǎn)便，但仍然是一項(xiàng)有創(chuàng)的檢查方法。拉曼光譜具有對(duì)樣品破壞程度低、迅速、操作簡(jiǎn)便、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本文就拉曼光譜技術(shù)的基本原理與優(yōu)點(diǎn)、在疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，以及便攜拉曼光譜儀的原理及應(yīng)用展開綜述，以探究拉曼光譜技術(shù)診斷血脂異常的可行性。

1 拉曼光譜技術(shù)的基本原理及特點(diǎn)

1.1 拉曼光譜的基本原理

1928年，RAMAN在一次涉及光學(xué)的實(shí)驗(yàn)中觀察到與原始入射光波長(zhǎng)不同的散射光，這種現(xiàn)象被稱為“拉曼散射效應(yīng)”[8]。當(dāng)一定頻率的入射光照射于樣品表面后會(huì)出現(xiàn)透射、吸收、散射3種情況。當(dāng)一束激光照射被測(cè)物體時(shí)，被測(cè)物體中含有的分子可以使入射光發(fā)生散射，大部分散射光的頻率與入射光相同，稱為瑞利散射；而由于樣品中分子振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)作用使一部分散射光發(fā)生偏移，不僅改變了光的傳播方向，而且改變了傳播頻率，稱為拉曼散射。這種發(fā)生偏移的光譜就是拉曼光譜，散射光與入射光頻率差值被稱為拉曼位移，其只與被測(cè)物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，與入射光頻率無(wú)關(guān)，每一種物質(zhì)有自己的特征拉曼光譜[9]。

對(duì)拉曼散射光進(jìn)一步分析，其中一部分散射光頻率小于入射光被稱為斯托克斯散射，另一部分散射光頻率大于入射光則被稱為反斯托克斯散射。因斯托克斯散射光較強(qiáng)，通常情況下用于物質(zhì)拉曼光譜測(cè)量[10]。拉曼光譜對(duì)于C-C、N=N、S-S鍵等電荷分布中心對(duì)稱的化學(xué)鍵散射很強(qiáng)，因此可以很好地反映一些分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，而且還可以測(cè)定分子的退偏比，有利于明確分子的對(duì)稱性，常用于分子結(jié)構(gòu)分析[11]。

1.2 拉曼光譜的特點(diǎn)

拉曼光譜對(duì)于樣品沒有特殊要求，不論樣品呈何形態(tài)，均可存在拉曼效應(yīng)。由于水的拉曼散射很微弱，所以拉曼光譜是研究水溶液及類似水溶液樣品中分子結(jié)構(gòu)的理想工具[12]。拉曼光譜亦具有高特異度、高分析效率及復(fù)雜樣品無(wú)需染色或標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，能以較低的成本提供樣品實(shí)時(shí)分子信息，故成為診斷疾病及預(yù)后評(píng)價(jià)的工具。

但傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)存在信號(hào)強(qiáng)度低、熒光干擾強(qiáng)等缺點(diǎn)，應(yīng)用比較受限。為克服這些缺點(diǎn)，隨之產(chǎn)生了許多新拉曼光譜技術(shù)，包括表面增強(qiáng)拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜、受激拉曼光譜等[13]。近幾年，隨著拉曼光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于材料、化工、環(huán)保生物、醫(yī)學(xué)、地質(zhì)等領(lǐng)域。

2 拉曼光譜技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用

2.1 惡性腫瘤

惡性腫瘤目前已成為人類健康最大的威脅。由于缺乏高效的癌癥篩查手段，以及對(duì)“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”等防癌策略認(rèn)知不足，我國(guó)癌癥患者5年生存率僅為30.9%[14]。目前，檢測(cè)腫瘤的3種主要方法為腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、影像學(xué)診斷和組織病理學(xué)診斷，其中組織病理學(xué)診斷是腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但也是一種有創(chuàng)的診斷方式，不僅要求檢測(cè)人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且診斷時(shí)效性差。拉曼光譜可以在分子水平上揭示腫瘤組織與正常組織結(jié)構(gòu)之間的差異，且不會(huì)改變樣品的性狀，故在腫瘤的良惡性判別、腫瘤的亞型分類、切片病理診斷等方面被廣泛應(yīng)用。腫瘤生物標(biāo)記物檢測(cè)是一種非侵入性的快速分析技術(shù)，而且腫瘤標(biāo)記物濃度低，化學(xué)成分復(fù)雜，可以利用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物成分，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)病理活檢的局限性，完成癌癥的早期篩查[14-15]。

2.2 病毒檢測(cè)

目前病毒感染的診斷方法有多種，主要為免疫檢測(cè)、核酸檢測(cè)、熱成像檢測(cè)等。其中核酸檢測(cè)是在新型冠狀病毒感染診斷中使用最多，也被世界公認(rèn)的重要方法。ANWAR等[15]在拉曼光譜儀的532 nm激光光源下檢測(cè)健康人、乙型肝炎(以下簡(jiǎn)稱乙肝)和丙型肝炎(以下簡(jiǎn)稱丙肝)患者血清。與健康人血清相比，峰值在1 006、1 157、1 513 cm-1處，乙肝和丙肝患者血清光譜的峰值隨著強(qiáng)度的降低而發(fā)生藍(lán)移。KHAN等[16]研究發(fā)現(xiàn)乙肝患者血清中的625、678、748、810、820、950、1 003、1 018、1 275 cm-1波峰強(qiáng)度高于健康人血清。乙肝和丙肝患者血清的拉曼光譜譜線波峰及波段與健康人血清光譜差異很大，該技術(shù)可被視為診斷乙肝和丙肝的有效工具。亦有研究表明，充分利用表面增強(qiáng)拉曼散射的“指紋圖譜”分析優(yōu)勢(shì)，利用DNA探針將拉曼活性分子與靶核酸連接，通過(guò)對(duì)DNA探針上拉曼活性分子信號(hào)變化的檢測(cè)和分析，可提高新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的靈敏度與特異度[17]。

2.3 血糖異常檢測(cè)

糖尿病是一種影響全球4.22億人的慢性非傳染性疾病，可能在未來(lái)幾年對(duì)公共健康構(gòu)成巨大威脅[18]。目前最先進(jìn)的血糖監(jiān)測(cè)器也需要患者每天取數(shù)次指間血，這種方法不僅有創(chuàng)、不便，而且有感染風(fēng)險(xiǎn)。在不同光學(xué)技術(shù)中，拉曼光譜是用無(wú)創(chuàng)技術(shù)診斷疾病最有前景的光學(xué)方法之一[19-20]。有研究者使用拉曼光譜儀采集12名志愿者微血管血糖的拉曼光譜來(lái)預(yù)測(cè)血糖，結(jié)果顯示激光聚焦甲襞微血管獲得的拉曼光譜峰在650、758、837、945、978、1 004、1 130、1 163、1 217、1 551、1 660 cm-1處很明顯，且比健康人血清譜峰要高，這些譜峰同樣也存在于血液中[21-23]。這表明可以使用無(wú)創(chuàng)的方法在體表進(jìn)行臨床范圍可接受的血糖預(yù)測(cè)，對(duì)研究無(wú)創(chuàng)血糖檢測(cè)具有重要意義，而且這種創(chuàng)新的方法還可以促進(jìn)其他血液成分的非侵入性檢測(cè)[24]。

3 基于拉曼光譜技術(shù)對(duì)樣品的定性及定量分析

定性和定量分析是拉曼光譜應(yīng)用于物質(zhì)分析科學(xué)中兩個(gè)最重要的方面。不同分子物質(zhì)有不同特征的拉曼光譜譜線，故可以用于物質(zhì)分子定性與結(jié)構(gòu)分析。光譜波峰的強(qiáng)度與分子物質(zhì)濃度成正比，因此可用于物質(zhì)的定量分析[25]。

拉曼光譜分析法在臨床上可用于對(duì)血紅蛋白含氧量的檢測(cè)[26]。董海勝等[27]利用血清拉曼光譜結(jié)合偏最小二乘法建立了膽固醇的濃度與光譜之間的模型及校正模型，表明應(yīng)用拉曼光譜結(jié)合偏最小二乘法建立模型可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血清膽固醇濃度的預(yù)測(cè)。拉曼光譜分析法可以對(duì)樣品進(jìn)行快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、無(wú)損傷的定性、定量分析，可以利用拉曼光譜這一特點(diǎn)，對(duì)血脂異?；颊哐暹M(jìn)行各血脂成分的定性及定量分析。

4 便攜拉曼光譜儀的原理及應(yīng)用

便攜拉曼光譜儀工作原理與大型拉曼光譜儀的工作原理相似，先是由光譜儀激光器發(fā)出一束激光聚焦在被測(cè)物體上，然后用探頭收集散射光，并濾去頻率沒有變化的散射光，再利用內(nèi)置光柵對(duì)不同波長(zhǎng)的散射光進(jìn)行分離，最后對(duì)光譜進(jìn)行收集和記錄，并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)后最終輸出，得到拉曼光譜[28]。

便攜式拉曼光譜儀以其快速無(wú)損、便攜等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。DINGAR等[29]表明，通過(guò)拉曼光譜和偏最小二乘法可以對(duì)血清樣品中的糖化清蛋白進(jìn)行體外定量。GUEVARA等[30]使用便攜拉曼光譜儀在糖尿病患者及健康人群不同解剖位置獲得拉曼光譜，然后結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及支持向量機(jī)等進(jìn)行算法分析，發(fā)現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合拉曼光譜檢測(cè)血糖的總體性能優(yōu)于毛細(xì)血管血糖測(cè)量，并且具有與糖尿病診斷金標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)男阅?。使用便攜拉曼光譜儀結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有可能在普通人群中進(jìn)行體外、無(wú)創(chuàng)、快速的糖尿病篩查。

5 小 結(jié)

脂質(zhì)是人體所需三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，脂質(zhì)代謝紊亂或異常容易導(dǎo)致高脂血癥，但早期高脂血癥患者并無(wú)任何癥狀和異常體征，不易早期發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期血脂異常容易引起心腦血管不良事件?，F(xiàn)有的血脂異常診斷方法雖然普及且簡(jiǎn)便，但仍然對(duì)人體造成一定的創(chuàng)傷，且不易提高血脂異常的早期檢出率。所以基于拉曼光譜技術(shù)，結(jié)合便攜拉曼光譜儀的可攜帶、方便性等優(yōu)點(diǎn)，研究出一種無(wú)創(chuàng)、高效的血脂異常篩查方法具有廣闊前景。