藍莓根部內生木霉分離鑒定及其拮抗作用

李 思 尚曉靜 張富美 侯 瑞

(貴州大學林學院，貴州 貴陽 550025)

藍莓(Vacciniumuliginosum)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物[1]。藍莓果實除普通水果含有的礦物質營養(yǎng)外，還含有豐富的花青素、黃酮、多酚、尼克酸、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等物質[2]。其中花青素具有較強的抗氧化活性，是傳統抗氧化劑的20～50倍[3]。此外，藍莓葉片中富含的酚類物質是一種潛在的抗氧化酚類資源[4]。藍莓因其極高的營養(yǎng)價值和經濟價值在中國種植面積逐年增加[5-6]。貴州省草莓主栽區(qū)為貴陽、麻江、息烽、鳳崗等地，種植品種主要為兔眼和高叢[7-8]。但由尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)[9]造成的藍莓根腐病，盤孢屬(Colletotrichumgloeosporioides)造成的藍莓炭疽病[10]和鏈格孢屬(Alternaria)造成的藍莓葉斑病[11]，成為近年來限制貴州藍莓產業(yè)發(fā)展的重要因素。

內生真菌指在生活史的某段時期生活于植物組織內部，但是沒有引起明顯植物病害癥狀的真菌[12]。內生真菌在植物組織中普遍存在，具有豐富的物種多樣性，主要棲息在植物的根部、莖部以及葉部[13-14]。木霉屬(Trichoderma)是常見的內生真菌，在自然界中分布十分廣泛，主要存在于森林、草地、農田、坡溝等較為潮濕的環(huán)境中，定植于植物根部可以增強根的生長，提高植物的抗逆性和抗病性，是重要的生防微生物資源[15-17]。研究發(fā)現，木霉菌對山豆根根腐病菌茄腐鐮孢(Fusariumsolani)[18]、黃瓜枯萎病(F.oxysporumf. sp.cucumerinum)[19]、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)和小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)[20-21]等均具有抑制作用，說明木霉菌具有競爭優(yōu)勢顯著、生長速度大于病原菌、抑制病原菌菌絲生長的特點，同時表明木霉菌具有廣譜性，對不同病原菌均能表現出良好的拮抗作用。木霉菌可以有效抑制鐮孢屬真菌產生玉米烯酮等真菌毒素，從而減少其對田間作物的污染，提高農產品的產量和質量[22]。此外，木霉菌和其他生物材料對植物根際土壤微生物區(qū)系具有一定影響，郭成瑾等[23]用哈茨木霉(T.harzianum)M-33協同小麥秸稈對馬鈴薯進行處理后，其根際土壤真菌數量較對照降低29.54%，細菌、放線菌和木霉菌的數量分別較對照提高75.36%、60.58%和1 407.27%，表明木霉菌和小麥秸協同處理能夠促進馬鈴薯根際土壤中有益微生物的聚集。

藍莓根部內生真菌具有多樣性，但有關藍莓根部內生木霉多樣性和功能的報道較少[24]。此外，不同菌株的田間防治效果差異較大，發(fā)掘新的高效菌株對生物防治具有重要意義。因此本研究從貴州省藍莓主栽區(qū)貴陽市花溪高坡生態(tài)藍莓園健康藍莓植株根部中分離純化到16株內生木霉菌株，分析其多樣性并對其生防效果進行測試、篩選高效抑菌菌株，以期為貴州省藍莓病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試藍莓植株采自貴州省貴陽市花溪高坡生態(tài)藍莓園(106°50′14E，26°16′46″N)，選取5至8年生健康兔眼藍莓品種圓藍和粉藍、高叢藍莓品種萊格西和奧尼爾根部，供分離內生真菌使用。

1.1.2 植物病原真菌 7種供試植物病原真菌為藍莓根腐病病原菌(尖鐮孢菌Fusariumoxysporum)、藍莓枝枯病病原菌(小新殼梭孢Neofusicoccumparvum)、藍莓枝枯病病原菌(Diaporthelongicolla)、藍莓葉斑病病原菌(交鏈格孢菌Alternariaalternata)、藍莓葉斑病病原菌(膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides)、辣椒炭疽病病原菌(尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum)、小麥赤霉病病原菌(禾谷鐮孢菌Fusariumgraminearum)，以上7種病原真菌均保存于貴州大學林學院森林病理實驗室，4℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓根部內生真菌分離培養(yǎng) 利用組織分離法對藍莓根部內生真菌進行分離培養(yǎng)，選取表面健康無病斑的藍莓根部，用清水洗凈后晾干。在超凈工作臺中，將表面健康無病斑的藍莓根在75%乙醇溶液中浸3 s，用無菌水沖洗5次，轉入3%(v/v)NaClO溶液中消毒3 min，用無菌水沖洗5次，放入75%乙醇消毒30 s，再用無菌水沖洗5次并吸干表面水分，在每個馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)中放5段藍莓根段，重復20個PDA培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d；同時采用植物組織印記法，將表面消毒的藍莓根直接在培養(yǎng)基表面輕抹，相同條件下培養(yǎng)5個PDA培養(yǎng)基作為對照。利用真菌菌落邊緣挑取法，挑取PDA平板培養(yǎng)基中生長形態(tài)差異典型的真菌轉接至新的PDA培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，純化3～5次。

1.2.2 內生真菌鑒定 采用十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)法[25]提取內生真菌DNA。利用通用擴增引物ITS和EF-1ɑ鑒定內生真菌，擴增菌株核糖體DNA內部轉錄間隔序列。參考王娜等[26]的方法對內生真菌rDNA-ITS、EF-1ɑ區(qū)段進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增以及產物純化。PCR擴增產物送至重慶擎科生物測試公司進行切膠、純化和測序。修正后的內生真菌測序片段利用NCBI數據庫中BLASTN對測序結果進行對比分析。為了解每個樣品受侵染的發(fā)生頻率，評價藍莓樣品中內生真菌的組成及其豐富程度。分別統計內生真菌的分離率(isolation rate, IR)[27]、分離頻率(isolation frequency, IF)[28]、香農-維納指數(Shannon-Weiner index,H′)、辛普森多樣性指數(Simpson index, D)、豐富度指數(Margalef index, M)、均勻度指數(Pielou index, E)[29-30]。

(1)

(2)

(3)

D=1-∑Pi2

(4)

(5)

(6)。

式中，N為菌株總數，Pi某種屬內生真菌的菌株數量占分離到的所有總菌株數量的百分數，S為物種數。

1.2.3 木霉菌對植物病原真菌的拮抗作用 參考劉青等[31]的平板對峙法測定內生木霉菌對7種植物病原真菌的拮抗作用。在超凈臺上用直徑5 mm的無菌打孔器截取新鮮內生木霉菌和植物病原菌菌絲接種于90 mm PDA平板兩側，使木霉菌和植物病原菌直徑相距50 mm，只在PDA平板中接種病原菌為對照(CK)。重復3組，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。測量CK病原菌菌落直徑和處理組病原菌菌落直徑。按公式(7)計算抑制率：

抑制率=

(7)。

1.2.4 無菌發(fā)酵液抑菌活性鑒定 選取5株對峙效果較好的木霉菌單獨進行無菌發(fā)酵液抑菌試驗。將5塊直徑為5 mm的新鮮木霉菌絲塊接種于裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)溶液的250 mL錐形瓶中，置于28℃、160 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，在超凈工作臺中，將經過4層無菌紗布過濾和經細菌過濾器(0.22 μm)后的濾液，與經120℃滅菌30 min的PDA以3∶2的比例混合，制作發(fā)酵液抑菌平板，待平板冷卻后，用直徑5 mm的無菌打孔器截取新鮮病原菌菌絲塊置于抑菌平板中央，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察并記錄病原菌的菌落直徑，按公式(7)計算抑制率。

1.2.5 數據分析 藍莓根部內生木霉多樣性采用Excel 2016和Origin 2018軟件進行統計和分析，抑菌率采用Excel 2016和SPSS 25軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 藍莓根部內生木霉種類鑒定

由表1可知，利用組織分離法共分離獲得菌落形態(tài)具有明顯差異的木霉菌16株。通過對rDNA-ITS和EF-1α基因序列進行比對，將16株木霉菌分為4個種，這些菌株與NCBI數據庫中已知木霉菌rDNA-ITS和EF-1α基因序列相似性均達98%～100%，兩種序列測序結果一致，同源性高。16株藍莓根部內生木霉，T.harzianum為優(yōu)勢種，共有6株，占木霉菌株總數的37.5%；T.virens次之，共有5株，占木霉菌株總數的31.25%；T.koningiopsis3株，占木霉菌株總數的18.75%；T.pubescens數量最少，共有2株，占木霉菌株總數的12.5%。

2.2 藍莓根部內生木霉系統發(fā)育樹分析

將16株木霉菌株(GF10、GF39、GL41、GL43、GY38、GA8、GA20、GF31、GF32、GL14、GL15、GL16、GL19、GL39、GL42)送至重慶擎科生物技術有限公司進行測序，獲得測序結果后登錄GenBank，上述菌株分別得到IST序列登錄號MW750422、MW750423、MW750424、MW750425、MW750426、MW750427、MW750428、MW750429、MW750430、MW750431、MW750432、MW750433、MW750434、MW750435、MW750436；GL11、GF39、GL41、GL43、GY38、GA8、GA20、GF31、GF32、GL14、GL15、GL16、GL19、GL39、GL42分別得到EF-1α基因序列登錄號MW812395、MW812396、MW812397、MW812398、MW812399、MW812400、MW812401、MW812402、MW812403、MW812404、MW812405、MW812406、MW812407、MW812408、MW812409。將ITS序列與BLASTN比對結果中同屬不同種的序列進行多序列比對分析，同時引入Fusariumoxysporum、Nectriaberolinensis兩個外源屬利用MEGA 7.0軟件中的Clustal W進行多序列比對，采用MEGA 7.0中鄰接法(neighbor-joining)構建系統發(fā)育樹。結果發(fā)現，菌株GL42、GF31、GF32、GF39與T.virens相似性為100%(圖1-A)；菌株GY38、GL41、GL43與T.koningiopsis相似性為100%(圖1-B)；菌株GA20、GA8與T.pubescens聚為一類，相似性為99%(圖1-C)；菌株GL11、GL14、GL15、GL16、GL19、GL39與T.harzianum聚為一類，相似性為99%(圖1-D)。結合菌落形態(tài)特征(圖2)、顯微形態(tài)特征(圖3)鑒定16株內生真菌分為T.virens、T.pubescens、T.harzianum、T.koningiopsis4種。

2.3 藍莓根部內生木霉菌多樣性

從花溪高坡生態(tài)藍莓園根部共分離得到103株內生真菌，木霉菌株16株，分離樣品組織塊總數為200。對分離得到的16株內生木霉菌進行多樣性分析可知(表2)，木霉菌總分離率為8%，分離頻率為15.53%，Shannon-Weiner多樣性指數為0.450 8，Simpson 多樣性指數為0.988 7，Pielou均勻度指數為0.345 0，Margalef豐富度指數為2.408 2。其中粉藍、萊格西、奧尼爾和圓藍4個藍莓品種木霉菌分離率分別為8%、18%、4%、2%(圖4)。

2.4 藍莓根部內生木霉對7種植物病原真菌抑制效果

挑選典型木霉菌與7種植物病原真菌對峙效果圖(圖5)，從圖中看出，木霉菌生長速度大于植物病原菌，培養(yǎng)至7 d時，木霉菌與病原菌完全接觸并抑制其菌落的生長，使病原菌菌絲生長速度變慢，甚至不再生長。對交鏈格孢菌，禾谷鐮孢菌，D.longicolla、小新殼梭孢、尖鐮孢菌、膠孢炭疽菌、尖孢炭疽菌的抑制率分別為35.01%～76.38%、52.24%～67.68%、58.43%～73.53%、51.18%～70.00%、26.21%～52.99%、37.18%～66.76%、37.37%～70.53%。其中GL15對交鏈格孢菌，GL19對禾谷鐮孢菌，GL39對D.longicolla，小新殼梭孢和尖鐮孢菌，GL42對膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的抑制率最高，分別為76.38%、67.68%、73.53%、70.00%、52.99%、66.76%、70.53%。

表1 藍莓根部內生木霉序列相似性分析Table 1 Sequence similarity analysis of Trichoderma endophyte from blueberry roots

表2 藍莓根部內生木霉菌多樣性Table 2 Diversity of endophytic Trichoderma in blueberry roots

綜合分析可知，16株木霉菌對尖鐮孢菌的抑制效果最差，對禾谷鐮孢菌、D.longicolla、小新殼梭孢的抑制效果最好，表明不同木霉菌對不同病原菌的抑制作用存在一定差異(表3)。

圖1 藍莓根部內生木霉IST序列系統發(fā)育樹Fig.1 IST Phylogenetic tree of endophytic Trichoderma in blueberry roots

表3 藍莓根部內生木霉菌對7種植物病原真菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of endophytic Trichoderma in blueberry roots on 7 phytopathogenic fungi /%

注：菌株GF10、GF39、GL42、GF31、GF32為T. virens；菌株GL41、GL43、GY38 為 T. koningiopsis；菌株GA8、GA20 為 T. pubescens；菌株 GL14、GL15、GL16、GL19、GL39、GL11 為 T. hamatum。Note: Strains GF10、GF39、GL42、GF31、GF32 are T. virens. Strains GL41、GL43、GY38 are T. koningiopsis. Strains GA8、GA20 are T. pubescens. Strains GL14、GL15、GL16、GL19、GL39、GL11 are T. hamatum.圖2 藍莓根部內生木霉菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of endophytic Trichoderma in blueberry roots

2.5 藍莓根部內生木霉菌發(fā)酵液對7種植物病原真菌抑制效果

結合對峙結果選擇T.harzianumGL11、T.harzianumGL15、T.harzianumGL19、T.harzianumGL39、T.virensGL42菌株共5株木霉菌進行無菌發(fā)酵液試驗，探究5株木霉菌發(fā)酵液對7種植物病原真菌的抑制效果。結果顯示，培養(yǎng)5 d后，除小新殼梭孢外，5株木霉菌發(fā)酵液均對其余6種植物病原菌具有一定的抑制作用，但不同或同種木霉菌發(fā)酵液對植物病原菌抑制效果之間具有一定的顯著差異(P<0.05)(圖6、表4)。其中GL11發(fā)酵液對尖鐮孢菌、膠孢炭疽菌的抑制效果最好，分別為17.95%、44.55%；GL15發(fā)酵液對Diaporthelongicolla、尖孢炭疽菌、交鏈格孢菌的抑制效果最好，抑制率分別為46.71%、36.49%、23.41%；GL19發(fā)酵液對禾谷鐮孢菌的抑制效果最好，抑制率為37.53%。

3 討論

目前關于藍苺內生木霉的研究報道較少[32-33]，本研究從藍莓根部分離的16株內生木霉菌分為T.virens、T.koningiopsis、T.harzianum、T.pubescens4種，其中T.harzianum為優(yōu)勢種，占木霉菌株總數的37.5%。葉馨等[34]從蘆葦Phragmitesaustralis根中分離純化得到長枝木霉T.longibrachiatum和桔綠木霉T.citrinoviride2種木雷菌；曲明星等[35]從柞樹的須根分離出Trichodermahamatum、T.virens、T.citrinoviride等12種木霉菌。說明植物根系中木霉菌具有多樣性，與本研究結果一致。木霉菌存在于絕大多數植物組織中，劉鳳紅[36]證明藍莓根系內生真菌除鐮孢屬(Fusarium)外，木霉屬(Trichoderma)同樣為優(yōu)勢種群；任瑋等[37]用組織分離法從蘭科植物杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)根中分離出木霉屬；張清華等[38]從桉樹(Eucalyptusspp.)葉片中分離得到哈茨木霉(T.harzianum)，并證明其菌絲能夠覆蓋桉樹焦枯病菌(Calonectriapseudoreteaudii)菌落抑制病原菌生長。本研究利用平板對峙法探究16株木霉菌對7種植物病原菌(交鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌、Diaporthelongicolla、小新殼梭孢、尖鐮孢菌、膠孢炭疽菌、尖孢炭疽菌)的抑制效果，結果顯示，16株木霉菌株對7種病原菌均有抑制效果，最高抑制率分別為76.38%、67.68%、73.53%、70.00%、52.99%、66.76%、70.53%，其中對尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌抑制效果最好的是T.virens，對其余6種病原真菌抑制效果最好的是哈茨木霉。Wang等[39]研究表明T.harzianumTh62菌株對土壤傳播的植物病原菌、尖鐮孢菌、交鏈格孢菌等具有明顯的拮抗作用；此外，哈茨木霉對煙草青枯病[40]、西瓜枯萎病[41]、柑桔綠霉病[42]等植物病害防治作用被廣泛研究。5株木霉菌發(fā)酵液對7種植物病原真菌的抑制結果顯示，除小新殼梭孢以外，5株木霉菌發(fā)酵液對其他6植物病原菌均有抑制效果，對Diaporthelongicolla、膠孢炭疽菌、禾谷鐮孢菌、尖孢炭疽菌、交鏈格孢菌、尖鐮孢菌的最高抑制率分別為46.71%、44.55%、37.53%、36.49%、23.41%、17.95%，其中無菌發(fā)酵液對6種病原菌抑制效果最好的是T.harzianum，可能是由于不同木霉菌株產生的代謝產物不同，導致其對不同或同種病原菌的抑制作用存在差異[43]。無菌發(fā)酵液對7種植物病原菌的抑制效果較差或沒有效果，可能的原因有：木霉菌發(fā)酵液濃度不夠高[44-45]；木霉菌發(fā)酵液中產生的幾丁質酶、多糖[46]、酸和酯類[47]等非揮發(fā)性物質較少，可在后續(xù)工作中通過對發(fā)酵時間、溫度、初始pH值的調控，提高生防真菌發(fā)酵液的抑菌率[48]。

注: A、A1分別為T. virens GL42的分子孢子和分生孢子梗；B、B1分別為T. koningiopsis GL41的分生孢子和分生孢子梗；C、C1分別為T. pubescens GA8的分生孢子和分生孢子梗；D、D1分別為T. hamatum GL19的分生孢子和分生孢子梗。標尺=20 μm。Note: A, A1 are conidia and conidiophore of T. virens GL42, respectively. B, B1 are conidia and conidiophore of T. koningiopsis GL41, respectively. C, C1 are conidia and conidiophore of T. pubescens GA8, respectively. D, D1 are conidia and conidiophore of T. hamatum GL19, respectively. Scale bar=20 μm.圖3 藍莓根部內生木霉顯微形態(tài)特征圖Fig.3 Micromorphological characteristics of endophytic Trichoderma in the root of blueberry

圖4 不同藍莓品種木霉菌分離率Fig.4 Separation rate of Trichoderma from different blueberry varieties

注：A～G分別為病原菌尖鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、膠孢炭疽菌、Diaporthe longicolla、尖孢炭疽菌、交鏈格孢菌、小新殼梭孢，下同; A1為T. harzianum GL15與尖鐮孢菌對峙效果；B1為T. virens GL42與禾谷鐮孢菌對峙效果；C1為T. virens GF31與膠孢炭疽菌對峙效果；D1為T. harzianum GL11與Diaporthe longicolla對峙效果；E1為T. harzianum G15與尖孢炭疽菌對峙效果；F1為 T. harzianum GL19與交鏈格孢菌對 峙效果；G1為T. harzianum G15與小新殼梭孢對峙效果(左邊為木霉菌株，右邊為病原菌)。Note: A～G are the pathogen Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Colletotrichum loeosporioides, Diaporthe longicolla, Colletotrichum acutatum, Alternaria alternata, Neofusicoccum parvum, the same as following. A1 is the confrontation effect between T. harzianum GL15 and Fusarium oxysporum. B1 is the confrontation effect between T. virens GL42 and Fusarium graminearum. C1 is the confrontation effect between T. virens GF31 and Colletotrichum gloeosporioides. D1 is the confrontation effect between T. harzianum GL11 and Diaporthe longicolla. E1 is the confrontation effect between T. harzianum G15 and Colletotrichum acutatum. F1 is the confrontation effect between T. harzianum GL19 and Alternaria alternata. G1 is the confrontation effect between T. harzianum G15 and Neofusicoccum parvum (Trichoderma strain is on the left, pathogenic bacteria on the right).圖5 藍莓根部內生木霉菌與7種植物病原真菌部分拮抗效果圖Fig.5 The effect of antogonism confrontation between endophytic Trichoderma in blueberry roots and 7 kinds of plant pathogenic fungi

表4 藍莓根部內生木霉菌發(fā)酵液對7種植物病原真菌抑制效果Table 4 The inhibitory effect of the fermentation broth of endophytic Trichoderma from blueberry roots on 7 kinds of plant pathogenic fungi /%

注：A1、B1為T. harzianum GL11發(fā)酵液對尖鐮孢菌和膠孢炭疽菌抑制效果圖；C1、D1為T. harzianum GL15發(fā)酵液對Diaporthe longicolla和尖孢炭疽菌抑制效果圖；E1為T. harzianum GL19發(fā)酵液對交鏈格孢菌抑制效果圖；F1、G1為T. harzianum GL39發(fā)酵液對 禾谷鐮孢菌和小新殼梭孢的抑制效果圖。Note: A1 and B1 are the inhibitory effects of T. harzianum GL11 fermentation broth on Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides. C1 and D1 are the inhibitory effects of T. harzianum GL15 fermentation broth on Diaporthe longicolla and Colletotrichum acutatum. E1 is a graph of the inhibitory effect of T. harzianum GL19 fermentation broth on Alternaria alternata. F1 and G1 are graphs of the inhibitory effect of T. harzianum GL39 fermentation broth on Fusarium graminearum and Neofusicoccum parvum.圖6 藍莓根部內生木霉菌發(fā)酵液對7種植物病原真菌部分拮抗效果Fig.6 The antagonism effect of the fermentation broth of blueberry root endophytic Trichoderma on 7 kinds of plant pathogenic fungi

4 結論

本研究從貴州省貴陽市花溪高坡生態(tài)藍莓園藍莓根部分離內生木霉，研究其多樣性及對植物病原的拮抗作用，共獲得16株4種木霉菌。對峙培養(yǎng)結果表明不同木霉菌對7種病原菌均有較好的抑制效果且抑制效果存在差異，最高為76.38%。5株發(fā)酵液對除小新殼梭孢外的6種病原菌具有抑制效果，但抑制率較對峙培養(yǎng)低，最高僅為46.71%。表明藍莓根部內生木霉具多樣性且對病原菌有拮抗作用，可用于藍莓病害防治。后期可進一步研究藍莓根部剩余的87株內生真菌的多樣性及生防效果，篩選高效抑菌菌株，從而為藍莓病害防治提供參考。