清肺湯對急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺損傷及炎性因子的作用研究*

王 叢 張璐瑤 侯海慧 唐艷芬△

（1.江蘇省南通市中醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學南通附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226000；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的首次提出是在50多年前，其特點是炎性肺損傷導致的肺實質硬化和實變、肺血管通透性改變、肺水含量增加，出現(xiàn)氣體交換障礙、血氧飽和度降低［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年有超過300萬人受ARDS影響，占全球ICU住院人數(shù)的10%，盡管一直對ARDS的發(fā)病機制、治療手段進行大量研究，其病死率仍較高［2-3］。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，運用中藥治療急危重癥已經(jīng)得到醫(yī)學界的認可，尤其是阻斷輕癥向重癥轉化的過程［4-5］。清肺湯具有清熱解毒、化痰宣肺平喘的功效，本實驗在前期研究基礎上，提出清肺湯通過減輕急性呼吸窘迫綜合征大鼠炎癥釋放及肺組織水腫的假設，并運用現(xiàn)代檢測手段進行驗證，明確清肺湯治療急性呼吸窘迫綜合征的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠50只，體質量180～220 g，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，許可證號：SCXK（黑）2019-001，實驗室溫度（25±2）℃，濕度45%～55%，通風、光照良好，給予清潔的飼料和水，大鼠自由進食，適應性喂養(yǎng)1周后，開始建立急性呼吸窘迫綜合征模型。動物倫理批準號：S20210224-064。

1.2 實驗藥物 清肺湯：金蕎麥30 g，魚腥草30 g，黃芩20 g，葶藶子20 g，熟大黃12 g，麻黃6 g。均為江陰天江藥業(yè)有限公司的中藥配方顆粒，實驗前2 h由南通市中醫(yī)院制劑室配置成實驗所需生藥濃度，4℃冰箱保存待用。每組用藥按照人與大鼠用藥換算公式計算劑量。

1.3 儀器與試劑 本實驗中所用手術器械購自上海醫(yī)療器械有限公司；AF-800電子精密天平購自上海精密公司天平儀器廠；實驗冰箱，海爾公司（青島）；WD-9405B水平搖床、DYY-7C電泳儀、DYCZ-40D轉移槽，北京六一生物科技有限公司；JB-P5包埋機、JB-L5凍臺，武漢俊杰電子有限公司；P70D20TL-P4微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司；RM2016病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；Allegra X-30系列離心機，美國Beckman公司，RM2235石蠟切片機，德國Leica公司；BX53顯微鏡、DP73顯微鏡拍照系統(tǒng)，日本OLUMPUS公司；脂多糖（LPS）購自上海源葉公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、降鈣素原（PCT）、C反應蛋白（CRP）、ELISA試劑盒均購自Biotopped公司；HE染色試劑盒Biosharp公司。

1.4 模型制備 將50只SD大鼠造模前禁食不禁水12 h后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，無睫毛反射后將大鼠頭高腳低仰臥固定于操作臺，操作臺與水平面呈45°，將氣管插管插入聲門內，除去空白組10只，其余大鼠氣管內滴注3 mg/kg LPS 100 μL，而后翻轉大鼠，使藥液均勻分布于大鼠兩肺內，約留置6 h，構建ARDS大鼠模型，空白組10只給予同體積的生理鹽水作為對照。如果大鼠出現(xiàn)精神萎靡、少動、食欲缺乏、呼吸急促、腹瀉等癥狀，說明造模成功［6］。

1.5 分組與給藥 模型建立成功后，將成模大鼠隨機分為4組，每組10只?？瞻捉M灌胃10 mL/kg蒸餾水，模型組予灌胃10 mL/kg蒸餾水，清肺湯高劑量組按20 g生藥/kg中藥液+10 mL/kg蒸餾水灌胃，清肺湯中劑量組按10 g生藥/kg+10 mL/kg蒸餾水灌胃、清肺湯低劑量組按5 g生藥/kg+10 mL/kg蒸餾水灌胃。各組早、晚各給藥1次，連續(xù)3 d。

1.6 標本采集與檢測 治療結束后各組隨機選取6只大鼠，按照0.4 mL/100 g體質量用10%水合氯醛腹腔麻醉，無睫毛反射后將大鼠仰臥操作臺，固定門齒及四肢，胸腹部消毒備皮，沿腹部正中線切開約3 cm切口，找到腹主動脈，采集血液，室溫靜置30 min后3 500 r/min離心15 min，-80℃保存?zhèn)溆?。剝離肺組織，沖洗后取部分組織固定于4%多聚甲醛固定液中，4℃保存。1）CRP和PCT含量。按照試劑盒說明書要求，采用ELISA法檢測檢測大鼠血漿中CRP、PCT含量。2）肺組織中炎性因子表達。ELISA試劑盒要求經(jīng)設置標準孔和樣品孔、加樣、加酶、溫育、配液及洗滌、顯色、終止反應、打開酶標儀450 nm波長處檢測肺組織中IL-6、IL-10和TNF-α的含量。3）肺組織病理觀察。將右下肺組織經(jīng)脫蠟、染色、脫水等制成石蠟切片，HE染色后鏡下觀察。4）肺水腫。右肺上葉用PBS充分洗凈，吸去多余水分，天平稱取標記濕重（W），將標本放入恒溫烤箱中90℃烘烤干燥24 h，稱重記錄干重（D），計算肺組織濕干重比（W/D）［7］，W/D=（濕重-干重）/干重×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組內比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 空白組大鼠造模前后無明顯變化，氣管滴注脂多糖后模型組大鼠活動減少、精神萎靡、反應較遲鈍、呼吸加快、攝食量減少、毛發(fā)暗淡，出現(xiàn)打噴嚏等情況，連續(xù)灌胃給予高、中、低劑量的清肺湯后癥狀明顯減輕、活動、精神、對外界刺激反應、攝食量均有不同程度好轉。

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化 見圖1?？瞻捉M大鼠肺組織中氣道腔上皮完整，管腔干凈，肺間質及肺泡腔未見明顯炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺組織中氣道腔可見分泌物，大范圍的肺泡間隔輕中度增厚，肺泡腔狹窄，上皮細胞增生，可見炎性細胞浸潤。清肺湯高、中、低劑量組大鼠肺組織中肺泡間隔增厚減輕，肺泡腔狹窄改善，上皮細胞增生減輕，可見少量炎性細胞浸潤，清肺湯高劑量組治療效果最顯著。

2.3 各組大鼠血漿CRP、PCT含量及肺組織W/D比較 見表1。與空白組比較，模型組大鼠血漿中CRP和PCT含量明顯升高、肺W/D質量比明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，清肺湯高、中、低劑量組中大鼠血漿中CRP和PCT含量明顯降低、大鼠肺W/D質量比明顯降低（P＜0.05）；與清肺湯高劑量組比較，清肺湯中、低劑量組CRP和PCT含量及肺組織W/D質量比均明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血漿CRP、PCT含量及肺組織W/D比較（±s）

表1 各組大鼠血漿CRP、PCT含量及肺組織W/D比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與清肺湯高劑量組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組n6 6 6 6 6 CRP（μg/mL）3.69±0.46 8.95±0.43#4.69±0.62*5.89±0.78*△7.19±0.53*△PCT（ng/L）488.88±41.92 951.18±78.59#641.83±33.248*734.89±44.14*△824.00±51.00*△肺組織W/D 2.97±0.36 6.46±0.41#4.39±0.25*4.95±0.48*△5.72±0.40*△

2.4 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6和IL-10含量比較 見表2。與空白組比較，模型組中大鼠肺組織中TNF-α、IL-6和IL-10含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，清肺湯高、中、低劑量組中大鼠肺組織中TNF-α、IL-6和IL-10含量明顯降低（P＜0.05）；與清肺湯高劑量組比較，清肺湯中、低劑量組TNF-α、IL-6和IL-10含量明顯升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6和IL-10含量比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6和IL-10含量比較（ng/L，±s）

組 別n IL-6IL-10TNF-α 6 6 6 6 6空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組40.68±2.59 107.28±9.67#49.98±5.13*70.20±4.73*△89.30±9.14*△78.55±9.38 171.99±17.99#84.59±7.05*112.94±13.78*△143.55±12.28*△73.47±6.98 188.26±21.18#88.18±6.90*111.42±18.18*△154.08±20.42*△

3 討 論

ARDS是由心源性以外的肺內、肺外因素所致的急性、進行性呼吸衰竭。主要表現(xiàn)是呼吸窘迫和頑固性低氧血癥，肺部影像學表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變［8-10］。本病歸屬于中醫(yī)學“喘證”“喘脫”“暴喘”范疇，多為本虛標實，虛實夾雜之證，病初為標實屬熱毒襲肺、痰熱壅肺；久病則本虛屬氣陰兩傷、心腎陽虛，本病病位在肺，發(fā)生發(fā)展與腎、心密切相關［11］。其發(fā)病機制復雜、病死率高、治療周期長，雖然隨著醫(yī)學發(fā)展呼吸支持治療手段在不斷進步，但病死率仍居高不下。近年來，中醫(yī)藥治療ARDS的臨床及實驗研究取得長足進步，除傳統(tǒng)辨證治療外，基本方隨癥加減、專方專藥的研究也為ARDS的治療提供了思路。

本實驗中所用的清肺湯是南通市中醫(yī)院肺病科協(xié)定處方，結合ARDS中醫(yī)病因病機特點選用金蕎麥、魚腥草、黃芩、葶藶子、熟大黃、麻黃組成。清肺湯應用于臨床近20年，其主要作用為清熱解毒、化痰宣肺平喘；方中金蕎麥、魚腥草為君，君臣相須為用共同清肺化痰、排膿消癰；黃芩、葶藶子為臣，黃芩協(xié)君藥清肺熱、解毒抗炎，葶藶子宣肺化痰、止咳平喘；大黃為使藥，通腑瀉熱解毒；麻黃溫肺平喘，佐君臣藥效同時又可反佐其他藥物寒涼之性［12-13］。清肺湯通過多靶點、多途徑、多機制發(fā)揮作用，對于綜合調控復雜的炎癥反應更具優(yōu)勢與特色，阻止病情進一步發(fā)展。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)清肺湯能減輕ARDS患者呼出氣冷凝液中炎性因子釋放［14-15］。本實驗以清肺湯高、中、低3種劑量干預ARDS大鼠，通過各組大鼠間比較闡述清肺湯對ARDS大鼠作用機制。通過一般狀態(tài)觀察，大鼠造模后出現(xiàn)少動、呼吸急促、毛色暗淡等情況；與空白組比較，模型組W/D、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-10均升高，說明造模后急性呼吸窘迫綜合征大鼠出現(xiàn)炎癥反應、出現(xiàn)肺組織水腫；與模型組比較，清肺湯高、中、低劑量組W/D、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-10均下降，說明經(jīng)過清肺湯治療后大鼠炎癥不同程度減輕、肺水腫減輕；與清肺湯高劑量組比較，各項觀察指標均優(yōu)于中、低劑量組，說明清肺湯治療效果與用藥濃度有關；HE染色可見清肺湯治療后各組大鼠與模型組比較肺組織炎性滲出明顯減輕，清肺湯高劑量組好轉最顯著。本實驗說明清肺湯可能是通過減輕急性呼吸窘迫綜合征大鼠炎性介質釋放從而減輕肺損傷。