Ki-67表達(dá)及四種分子分型對(duì)髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)分級(jí)

李亞明 劉獻(xiàn)志

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童最常見(jiàn)、多發(fā)生在顱內(nèi)小腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、原發(fā)性的高度惡性的腫瘤［1-2］。未進(jìn)行手術(shù)結(jié)合放化療的患者的3～5 a 的無(wú)進(jìn)展生存率（event-free survival，EFS）較低［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物對(duì)MB 患者的預(yù)后有影響，這些標(biāo)志物可能成為治療MB 新的靶點(diǎn)。Ki-67是增殖細(xì)胞的細(xì)胞核抗原，作為其中的一種增殖標(biāo)志物，廣泛表達(dá)在細(xì)胞周期的所有階段及有絲分裂的細(xì)胞核中［4］。Ki-67 的免疫組化（IHC）染色被用于評(píng)價(jià)更具侵襲性的表型的鑒別。Ki-67 增殖指數(shù)在多種類(lèi)型的癌癥中也成為了重要的預(yù)后指標(biāo)［5］。Wingless（WNT）、Sonic Hedgehog（SHH）、GROUP 3和GROUP 4 亞型為MB 的四分型，由于四分型具有不同的細(xì)胞遺傳學(xué)特征、遺傳畸變、基因表達(dá)譜，因此其預(yù)后也不相同［6］。目前國(guó)內(nèi)無(wú)Ki-67 表達(dá)及MB四分型對(duì)MB 患者預(yù)后進(jìn)行分級(jí)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討Ki-67表達(dá)及MB四分型對(duì)患者的預(yù)后危險(xiǎn)分級(jí)是否可能是MB 患者中一個(gè)潛在的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，為MB的臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料入組2009-01—2018-01 于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除治療且術(shù)后病理報(bào)告結(jié)果為MB，同時(shí)行免疫組化Ki-67 檢測(cè)的92 例患者。所有入選患者均享有本研究知情同意權(quán)，并親筆簽署知情同意書(shū)。該研究資料收集遵守《赫爾辛基宣言》的規(guī)定。本研究設(shè)計(jì)通過(guò)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核、批準(zhǔn)（2019-KY-176）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）術(shù)前檢查均顯示無(wú)明顯手術(shù)禁忌證；（2）術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為MB并行Ki-67和四分型檢測(cè)。排除臨床資料不完整者。

1.3 Ki-67檢測(cè)選取92例MB患者的腫瘤組織，經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋組織，選取最大面積處切片（厚度＜4 μm）。按照免疫組化操作流程操作。Ki-67 兔抗人（北京中杉）。設(shè)置質(zhì)控片：采用Ki-67明確表達(dá)陽(yáng)性的切片做為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照設(shè)置PBS代替一抗。

1.4 四分型檢測(cè)92 例MB 患者的腫瘤組織通過(guò)10%的福爾馬林固定及石蠟包埋（FFPE）組織。從FFPE 組織中提取RNA，然后根據(jù)NORTHCOTT 等［7］描述的方法，采用基于NanoString的檢測(cè)方法檢測(cè)腫瘤樣本的四分型。WNT、SHH、GROUP 3和GROUP 4亞型按CodeSet進(jìn)行分類(lèi)，CodeSet由22個(gè)基因組成，每個(gè)亞型中有5～6個(gè)特征基因：WNT：DKK2、EMX2、GAD1、TNC、WIF1，SHH：ATOH1、EYA1、HHIP、PDLIM3、SFRP1，GROUP 3：EGFL11、GABRA5、IMPG2、MAB21L2、NPR3、NRL，GROUP 4：EOMES、KCNA1、KHDRBS2、OAS1、RBM24、UNC5D。

1.5 隨訪電話或門(mén)診收集獲得隨訪資料。查閱臨床病案系統(tǒng)且從中歸納收集患者臨床資料，其中包括：性別、年齡、術(shù)前生存質(zhì)量評(píng)分（Karnofsky Performance Status，KPS）、切除程度、放療及化療等信息?？偵嫫冢∣verall Survival，OS）代表手術(shù)與死亡或隨訪結(jié)束之間的間隔時(shí)間，無(wú)進(jìn)展生存期（Progression-free survival，PFS）是指從診斷之日到疾病進(jìn)展復(fù)發(fā)、死亡或最后隨訪的日期之間的間隔時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選用SPSS 22.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選用Kaplan-Meier 生存曲線計(jì)算統(tǒng)計(jì)分析OS、PFS 的生存率，Log-rank 統(tǒng)計(jì)采用單因素生存分析比較，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估采用多因素分析比較。設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 影響MB患者預(yù)后的單因素分析單因素分析結(jié)果顯示，年齡、切除程度、放療、化療均為影響MB患者預(yù)后的因素。見(jiàn)表1。

2.2 Ki-67 和MB 四分型對(duì)患者預(yù)后的影響根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1］，本文選取Ki-67 等于50%為臨界值做預(yù)后的生存分析，92 例患者中，Ki-67≤50% 50 例（54.3%），5 a PFS及OS分別為46.9%、63.1%；Ki-67＞50% 42 例（45.7%），5 a PFS 及OS 分別為28.5%、32.0%。兩者PFS 和OS 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020，P=0.028）。見(jiàn)表1、圖1。92 例患者中WNT、SHH、GROUP 3 和GROUP 4 亞型分別為16 例（17.4%）、14 例（15.2%）、40 例（43.5%）和22 例（23.9%），5 a PFS和OS分別為78.0%、76.0%、19.2%、19.9%和82.1%、76.0%、40.2%、0%。見(jiàn)表1。PFS 和OS 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，P=0.039）。見(jiàn)圖1C、1D。

圖1 髓母細(xì)胞瘤患者Ki-67表達(dá)和四分型與髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系Figure 1 The relationship between Ki-67 expression and tetratype in medulloblastoma patients and prognosis of medulloblastoma patients

表1 影響髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后因素的單因素分析Table 1 Univariate analysis of prognostic factors in patients with medulloblastoma

2.3 Ki-67表達(dá)和四分型對(duì)MB 患者預(yù)后危險(xiǎn)分級(jí)根據(jù)Ki-67 表達(dá)和四分型對(duì)MB 患者預(yù)后有影響，將同時(shí)滿足Ki-67≤50%、WNT 和SHH 亞型MB 患者劃分為低危組（Low risk group，n=12），同時(shí)滿足Ki-67≤50%、GROUP 3 和GROUP 4 亞型及Ki-67＞50%、WNT 和SHH 亞型MB 患者劃分為中危組（Intermediate risk group，n=56），將Ki-67＞50%、GROUP 3 和GROUP 4 亞型MB 患者劃分為高危組（High risk group，n=24）。低、中和高危組MB患者的預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PFS，P＜0.001，OS，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后危險(xiǎn)分組對(duì)預(yù)后的影響Figure 2 The effect of prognostic risk grouping on prognosis in patients with medulloblastoma

2.4 影響髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后因素的多因素分析將對(duì)MB患者預(yù)后有影響的因素納入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估，結(jié)果顯示未進(jìn)行放療、危險(xiǎn)分級(jí)為MB患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

世界衛(wèi)生組織（WHO）2016［8］和2021版［9］對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類(lèi)進(jìn)行了總結(jié)，從中可以發(fā)現(xiàn)WNT，SHH，GROUP 3 和GROUP 4 亞型是被廣泛接受的MB 的基因分型，應(yīng)被廣泛應(yīng)用到MB 的臨床分子病理診斷中。此外，有研究表明［10-12］，WNT亞型患者長(zhǎng)期生存率超過(guò)90%，預(yù)后最好，PHOENIX［13］等研究闡述了與其他亞型相比，WNT 亞型即使發(fā)生轉(zhuǎn)移也可以治愈，其發(fā)現(xiàn)WNT亞型MB缺乏功能性的血-

腦屏障（blood barain barrier，BBB），這有利于全身化療進(jìn)入WNT 亞型腫瘤，有利于WNT 亞型MB 的治療，與此同時(shí)，BBB的破壞是由腫瘤分泌的WNT拮抗劑阻斷了鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的旁分泌WNT 信號(hào)的正常過(guò)程，這種信號(hào)誘導(dǎo)了血管和屏障生成，并在整個(gè)生命中維持了BBB。因此，抑制WNT以破壞BBB并改善化療效果是一種機(jī)制［14-15］。SHH 亞型MB 是以Sonic Hedgehog信號(hào)通路命名的，該通路被認(rèn)為在很多此類(lèi)病例中促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［10］。研究表明針對(duì)平滑蛋白（SMO）的小分子對(duì)SHH 亞型MB 暫時(shí)非常有效，突出了開(kāi)發(fā)有效和實(shí)用的SHH 亞型MB 標(biāo)志物和靶向治療的前景［10，12，16-20］。由于本研究對(duì)其余兩個(gè)亞型的生物學(xué)知識(shí)了解較少，因此共識(shí)是在這些亞型的基本生物學(xué)知識(shí)得到更好的界定之前，暫時(shí)保留通用名稱［10］?？傊肿臃中筒粌H有助于確定有些藥物（SHH 抑制劑）的目標(biāo)隊(duì)列，還能大大增加診斷時(shí)的結(jié)果預(yù)測(cè)，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。Ki-67 作為一種增殖標(biāo)志物，在本文中Ki-67 的增高預(yù)示MB 患者預(yù)后差，且Ki-67 被廣泛應(yīng)用于腫瘤分子病理的診斷，本文對(duì)MB 診斷時(shí)結(jié)果的預(yù)測(cè)、患者個(gè)體化治療以及相關(guān)靶向藥物的開(kāi)發(fā)都具有指導(dǎo)意義。目前筆者針對(duì)現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)本，只進(jìn)行了四分型和Ki-67的測(cè)定。

目前，髓母細(xì)胞瘤患者的治療仍是以手術(shù)切除為主，輔助放化療的綜合治療方法。國(guó)內(nèi)仍根據(jù)患者年齡、手術(shù)切除程度、有/無(wú)轉(zhuǎn)移和病理類(lèi)型對(duì)MB患者進(jìn)行危險(xiǎn)程度分級(jí)［21-24］：標(biāo)危組（年齡＞3 歲兒童MB）：腫瘤完全切除或近完全切除（殘留病灶≤1.5 cm2），無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移；高危組（年齡＞3歲兒童MB）：手術(shù)次全切除（殘留病灶＞1.5 cm2）；伴有轉(zhuǎn)移性疾病（包括神經(jīng)影像學(xué)播散性疾病，手術(shù)14 d后腰穿或腦室腦脊液陽(yáng)性細(xì)胞學(xué)證據(jù)或顱外轉(zhuǎn)移；病理類(lèi)型為彌漫間變型）。標(biāo)危組（年齡≤3歲兒童MB）：同時(shí)符合腫瘤完全切除或近完全切除（殘留病灶≤1.5 cm2）、無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、病理類(lèi)型為促結(jié)締組織增生型和廣泛結(jié)節(jié)性；高危組（年齡≤3 歲兒童MB）：除標(biāo)危外。2015 年RAMASWAMY 等［25］結(jié)合分子分型重新定義兒童（3～17歲）MB危險(xiǎn)分級(jí)。根據(jù)預(yù)后5 a生存率分為4組：（1）低危組（＞90%）：無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的WNT 型、無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和伴染色體11 的缺失或染色體17 獲得的GROUP 4；（2）標(biāo)危組（75%～90%）：無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、不伴T(mén)P53 突變和無(wú)MYCN 擴(kuò)增的SHH，無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和MYC 擴(kuò)增的GROUP 3 型，無(wú)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和不伴染色體11缺失的GROUP 4型；（3）高危組（50%～75%）：伴有轉(zhuǎn)移的SHH 或GROUP 4，MYCN 擴(kuò)增的SHH；（4）超高危組（＜50%）：伴有轉(zhuǎn)移的GROUP 3和TP53突變的SHH。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道［19］，但尚無(wú)根據(jù)分子分型對(duì)MB進(jìn)行危險(xiǎn)分級(jí)的相關(guān)研究。

表2 影響髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后因素的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors in patients with medulloblastoma

Ki-67作為一個(gè)近核仁區(qū)且相對(duì)分子量為35 000的核抗原，能標(biāo)記細(xì)胞周期的除G0期外的G1、S、G2和M期細(xì)胞核，其表達(dá)量也隨細(xì)胞周期逐漸增加［26］。Ki-67能夠快速識(shí)別處于增殖分裂期的細(xì)胞，可以評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖活性，其表達(dá)量的高低與腫瘤惡性程度和生存期等密切相關(guān)［27-29］。Ki-67 表達(dá)量的增加，預(yù)示著MB患者預(yù)后較差［4］。本研究也再次證實(shí)了在MB患者中Ki-67≤50%較Ki-67＞50%的預(yù)后好。

本研究證實(shí)Ki-67≤50%的MB 患者較Ki-67＞50%的患者預(yù)后好，以及四分型MB 患者預(yù)后的不同。本文將同時(shí)滿足Ki-67≤50%和WNT、SHH亞型MB 患者分為低度危險(xiǎn)組；滿足Ki-67≤50%和GROUP 3、GROUP 4 亞型以及Ki-67＞50%和WNT，SHH亞型的MB患者分為中度危險(xiǎn)組；最后將Ki-67＞50%和GROUP 3、GROUP 4亞型的MB患者分為高度危險(xiǎn)組。3組患者的預(yù)后具有明顯的差異，且危險(xiǎn)分組為影響MB患者預(yù)后因素的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)，本研究也存在一些不足，未進(jìn)行染色體1q、7 和17q的擴(kuò)增，以及染色體8、染色體11和染色體17p缺失、TP53 突變、MYCN 和MYC 擴(kuò)增等的檢測(cè)，另外，需要多中心的研究。本研究也提示在今后的臨床治療工作中，對(duì)MB 患者采取規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化綜合治療的同時(shí)，更應(yīng)嚴(yán)格采取對(duì)不同危險(xiǎn)分級(jí)的MB患者選擇不同規(guī)范化的綜合治療策略，以望能夠提高M(jìn)B患者的生存率。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。