低致敏食品制備技術(shù)及其工業(yè)化應(yīng)用研究進展

李 欣 胡 巍 譚宏凱 黎晶晶 陳紅兵

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室, 江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院, 江西 南昌 330047；3.江西省食物過敏重點實驗室, 江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047)

食物過敏(food allergy,FA)被定義為機體暴露于某些食物過敏原所產(chǎn)生的免疫不良反應(yīng)[1],通常表現(xiàn)為皮膚、呼吸道、消化道等組織器官相關(guān)的臨床癥狀,嚴(yán)重時可威脅生命安全[2]。 據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究,食物過敏的發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[3],其中嬰幼兒的過敏發(fā)生率比成年人高。 如2006年至2016年美國的嬰幼兒食物過敏患病率從1.8%升高至7.6%[4-5],英國的嬰幼兒患病率由2006年的4.0%升高至2016年的7.1%[6-7],我國小范圍調(diào)查則表明,2009年至2019年0～2歲嬰幼兒患病率由7.7%升高至11.1%[8]。 早在1985年聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)食品法典委員會即提出“八大類”過敏食物,分別是雞蛋、牛奶、花生、大豆、魚、海鮮、小麥和堅果[9]。 2020年,基于食物過敏發(fā)病率、嚴(yán)重程度、致敏能力數(shù)據(jù)的風(fēng)險評估,FAO/WHO 食物過敏風(fēng)險評估專家組推薦全球優(yōu)先標(biāo)示的過敏食物為牛乳、雞蛋、花生、特定的堅果(杏仁,腰果,榛子,美國碧根果,開心果和核桃)、魚、芝麻、含面筋蛋白的谷物以及甲殼類水產(chǎn)品[10]。 盡管醫(yī)學(xué)界尚在不斷尋找有效的治療手段,但迄今為止,避免過敏食物仍然是防治食物過敏最有效的方法。 然而,在食品加工多元化的背景下,FA 患者要完全避免過敏原十分困難。 因此,研發(fā)并生產(chǎn)低致敏食品對FA 患者的健康而言至關(guān)重要。

1 低致敏食品制備技術(shù)分類及作用機制

1.1 熱加工對食物過敏原致敏性的影響

目前已廣泛研究由熱處理引起的食物過敏原致敏性變化,熱處理可以分為濕熱處理(煮、蒸、油炸)和干熱處理(焙烤、微波)。 加熱可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性,致敏性構(gòu)象表位被破壞,重新排列或形成新的分子內(nèi)或分子間鍵,導(dǎo)致表位不再被IgE 抗體所識別或觸發(fā)免疫反應(yīng),從而降低食物過敏原的致敏性[11-16]。 與生雞蛋相比,煮、蒸、焙烤、煎炸均能降低雞蛋的致敏性,其中烘烤和煎炸方法最為有效,這是由于加工后可溶性過敏原如卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白和卵粘蛋白的含量下降,同時加工處理后的雞蛋過敏原致敏動物后,其Jagged2-Notch 信號通路介導(dǎo)的Th2 免疫應(yīng)答反應(yīng)下調(diào)[13]。 然而,在一些情況下,加熱也可能導(dǎo)致食物過敏原的致敏性升高,可能是由于構(gòu)象變化致使隱藏的氨基酸被暴露或新的過敏原表位產(chǎn)生；也可能是由于食物過敏原對變性具有抵抗力,在加熱條件下仍保持誘發(fā)免疫反應(yīng)的能力。 Faisal 等[15]發(fā)現(xiàn)溫度和水的存在似乎是控制食物過敏原致敏性的重要因素,在油炸或煮沸過程中升高溫度會使蝦原肌球蛋白的抗原性增加,可能是由于結(jié)構(gòu)展開致使原肌球蛋白的隱藏表位被進一步暴露。

1.2 非熱加工對食物過敏原致敏性的影響

大量研究已證實非熱加工會對蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)修飾并影響其致敏性,本質(zhì)上是蛋白質(zhì)致敏性構(gòu)象表位在蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)修飾過程中可能被打斷、掩蔽或愈加暴露,表位的呈現(xiàn)情況與過敏原的IgE 結(jié)合能力緊密相關(guān),影響著過敏原的致敏性[17]。 目前消減食物致敏性的非熱加工技術(shù)主要包括高壓、脈沖電場、脈沖光、低溫等離子體、輻照和超聲等。

高壓加工引起過敏原蛋白的變性、展開和聚集,從而改變構(gòu)象表位及其IgE 結(jié)合能力,可以有效地降低食物免疫反應(yīng)性[18]。 如Yao 等[19]的研究結(jié)果表明高壓加工處理致使過敏原蛋白趨于聚集,面筋分子之間的疏水相互作用增強且二硫鍵含量升高,有助于降低小麥的致敏性,在400 MPa 20 min 的處理條件下小麥的致敏性降低了72.2%。

脈沖電場因具有降低食物致敏性的作用潛力,近年來逐漸被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾。 如涂宗財?shù)萚20]研究了25 kV/cm 強度的脈沖電場對牛乳β-乳球蛋白免疫反應(yīng)性的影響,在處理時間為210 μs 時過敏原的致敏性下降58%。 Yang 等[21]發(fā)現(xiàn)隨著電場強度和處理時間的提升,蛋制品的致敏性先升高后降低。 可能是因為在低場強條件下雞蛋過敏原結(jié)構(gòu)部分展開從而致使表位更加暴露。

在低致敏食品開發(fā)研究領(lǐng)域,脈沖光技術(shù)多以脈沖紫外光的形式出現(xiàn)。 由于含有大量的發(fā)色基團,蛋白質(zhì)易于發(fā)生光反應(yīng)。 在吸收光后蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化,進而發(fā)生交聯(lián)、聚集或者發(fā)生結(jié)構(gòu)修飾和多肽鏈斷裂,致敏表位隨之減少[22-23]。 如Yang 等[24]設(shè)置了2 ～6 min 的脈沖紫外光處理,結(jié)果表明大豆過敏原隨著處理時間的增加而減少并且IgE 結(jié)合能力在4 min 時降低了44%。

低溫等離子體可能通過注入活性氧自由基促進液體中的反應(yīng)或促進不溶性蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生,從而改變表位結(jié)構(gòu)[25]。 如Ng 等[26]比較了火花放電和輝光放電兩種方式的大氣低溫等離子體技術(shù)在牛乳脫敏中的作用,SDS-PAGE 和LC-MS/MS 鑒定結(jié)果顯示α-乳白蛋白含量減少,ELISA 定量結(jié)果表明α-乳白蛋白和酪蛋白的致敏性顯著降低。

隨著近年來非熱加工技術(shù)的發(fā)展,輻照技術(shù)在食物過敏中的應(yīng)用日益增多。 輻照后的過敏原蛋白會發(fā)生一定程度的交聯(lián)和聚集,這種現(xiàn)象是由光子直接或活性氧間接破壞過敏原結(jié)構(gòu)中的共價鍵所引起。 如羅春萍等[27]研究發(fā)現(xiàn)劑量超過10 kGy 的60Co-γ可以降低花生的致敏性,Ara h 2 免疫印跡條帶幾乎消失且IgG 結(jié)合能力均低于10%。 輻照消減致敏性的另一種可能機制是輻射后水分子會產(chǎn)生大量羥基自由基,它們通過與氨基酸中的自由基反應(yīng)引發(fā)過敏原表位肽的交聯(lián)或斷裂[28]。

超聲在介質(zhì)中傳播時會產(chǎn)生熱效應(yīng)、機械效應(yīng)或空化效應(yīng),過敏原物質(zhì)能吸收超聲波的能量并將其轉(zhuǎn)換成熱能,而這種熱能可將過敏原物質(zhì)降解[29]。 如Wang 等[30]利用20 kHz 400 W 的高強度超聲處理16 min,成功地將獼猴桃過敏原的含量降低了50%,并指出致敏性的降低是因為超聲顯著破壞了獼猴桃組織的微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

熱加工與非熱加工技術(shù)對不同種類食物過敏原致敏性的代表性影響見表1[11-16,19-21,24,26-27,30-43]。

表1 不同加工技術(shù)對食物過敏原致敏性的影響Tab.1 Effects of different process technology on allergenicity of food allergens

1.3 其他加工方法對食物過敏原致敏性的影響

除熱加工與非熱加工外,酶水解、酶交聯(lián)、糖基化、微生物發(fā)酵等方法通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象或?qū)⒌鞍踪|(zhì)與糖類物質(zhì)結(jié)合,破壞或隱藏過敏原表位,使得食物過敏原致敏性有效降低[44-46]。 另外,通過現(xiàn)代育種技術(shù)也可以達到消減甚至消除食品原料致敏性目的。 如Nishio 等[47]通過γ 射線誘導(dǎo),獲得了過敏原蛋白含量降低的4 種水稻突變體。 運用基因改良、基因移除和基因沉默技術(shù)也可以降低食物蛋白質(zhì)的過敏性,如Kalunke 等[48]利用RNAi 沉默獲得3個小麥轉(zhuǎn)基因品系,并證明這3 個轉(zhuǎn)基因品系與IgE 的結(jié)合能力都顯著降低。

2 低致敏蛋白配料的工業(yè)化生產(chǎn)

最早于20 世紀(jì)40年代,人們開始生產(chǎn)基于水解牛奶蛋白的配方粉,水解乳蛋白是通過化學(xué)或酶水解降低牛奶蛋白的分子量和肽鏈長度,減低或消除牛奶蛋白的免疫原性,繼而減少發(fā)生牛奶蛋白過敏的風(fēng)險[49-50]。 根據(jù)蛋白水解物和產(chǎn)品類型的不同,其工藝流程也略有不同,一般工業(yè)化的水解乳蛋白的制備主要有3 種方法[51]。 1)直接酶解法。 將選定的酶直接添加到蛋白溶液中,在酶活性的最佳條件下進行水解,直到達到所需的水解程度。 2)膜生物反應(yīng)器。 可用于連續(xù)水解并過濾出一定分子量的目的水解產(chǎn)物。 3)固定化酶解法。 將蛋白酶通過共價鍵結(jié)合在固體基質(zhì)或膜上,并用于制備蛋白水解物。 另外,根據(jù)蛋白水解的程度可將水解蛋白分為部分水解蛋白和深度水解蛋白[52]。

2.1 部分水解乳蛋白的制備

牛乳中的乳清蛋白為適度水解配方乳的主要原料,部分水解配方中肽段分子質(zhì)量主要集中在3 ～10 kDa[53]。 歐盟標(biāo)準(zhǔn)EU2016/127 第21 條規(guī)定,蛋白質(zhì)水解物制成的配方奶粉中蛋白質(zhì)含量不得低于1.86 g/100 kcal(4.44 ×104g/J),同時對水解乳蛋白的所用蛋白質(zhì)原料進行規(guī)定:應(yīng)使用凝乳酶沉淀酪蛋白后提取的脫鹽甜乳清蛋白。 該脫鹽甜乳清蛋白包含以下成分:w=63%的乳清蛋白分離物(不含酪蛋白糖肽、蛋白質(zhì)含量高于干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的95%、灰分不大于3%)和w=37%的甜乳清蛋白濃縮物(蛋白質(zhì)大于干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的87%、灰分不大于3.5%),同時要求其中變性的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于70%。

2.2 深度水解乳蛋白的制備

目前,在深度水解蛋白配方乳粉所包含的肽中,95%以上分子質(zhì)量低于3 kDa[54]。 主要以乳清蛋白為原料的深度水解蛋白已經(jīng)商業(yè)化。 深度水解乳蛋白制備的第一步是在選定的牛奶蛋白中添加肽酶。肽酶可以分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩種,通常會將兩種酶混合使用。 內(nèi)肽酶在蛋白質(zhì)內(nèi)的特定氨基酸上破壞蛋白質(zhì),而外肽酶則從蛋白質(zhì)肽鏈末端位置切割蛋白質(zhì)。 目前常用的酶包括胃蛋白酶和胰蛋白酶為代表的動物源水解酶以及木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶為代表的植物源水解酶[51]。 酶解后需要對酶進行滅活,防止進一步發(fā)生不受控制的水解,影響產(chǎn)品味感,而且滅活酶也是避免嬰兒攝入后產(chǎn)生不良反應(yīng)的安全措施的一部分,該過程需要嚴(yán)格驗證。

2.3 其他低致敏食物的制備

由于乳清蛋白在牛奶中含量相對較低,價格昂貴,酪蛋白水解物可被用于部分替代乳清蛋白,使用不同的酶解條件可以制備深度水解或適度水解酪蛋白[55-56]。 近年來人們開始探索采用其他哺乳動物來源的蛋白質(zhì)來替代牛奶蛋白,如山羊奶、駱駝奶和馬奶。 然而,由于氨基酸序列與牛奶蛋白存在一定的同源性,免疫交叉反應(yīng)可導(dǎo)致牛乳過敏患者對這些動物奶無法耐受。 從牛乳過敏管理的角度而言,目前尚缺乏對其他動物來源嬰配奶粉科學(xué)的致敏性安全評價研究[57]。 此外,由于大米的低致敏性以及牛奶蛋白和大米蛋白之間不存在免疫交叉反應(yīng),水解大米蛋白配方適用于牛乳蛋白過敏兒童的飲食[58]。 大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)的食物蛋白,以大豆蛋白為原料進行水解,制備低致敏水解大豆蛋白配料也值得關(guān)注。 基于大豆和水解大米的嬰兒配方奶粉耐受性良好,在一些國家被認(rèn)為是牛乳過敏嬰幼兒的第二選擇,但已有報道證據(jù)表明,植物蛋白配方奶粉不一定能滿足嬰幼兒的營養(yǎng)需求[59],值得關(guān)注。

3 結(jié)論

目前有關(guān)低致敏食品制備技術(shù)原理的研究大多還停留在全蛋白水平,未來應(yīng)更多關(guān)注針對過敏原表位的致敏性消減技術(shù)。 同時,目前低致敏產(chǎn)品的質(zhì)量評估未形成統(tǒng)一且完整的技術(shù)體系,且致敏性和營養(yǎng)吸收效果僅以分子質(zhì)量作為評判依據(jù),由此可見其檢測指標(biāo)也有待更進一步完善。 更重要的是,應(yīng)進行動物和臨床試驗進一步評價低致敏食品的安全性。 對于低致敏食品的研發(fā)而言,希望本文可為工業(yè)化生產(chǎn)低致敏食品提供最新參考信息。