ELOVL6在人卵巢漿液性腺癌組織中的表達及對卵巢癌細胞增殖、侵襲及凋亡能力的影響

李富娟，邢艷霞，楊艷麗，蘇英

卵巢漿液性腺癌是卵巢癌的具體病理亞型，主要分為高級別漿液性腺癌和低級別漿液性腺癌[1]。由于卵巢癌早期多無癥狀，大部分患者發(fā)現時已是晚期，并且卵巢癌的總體預后效果較差，一般很難治愈，早期5年生存率較高，晚期容易復發(fā)及轉移，所以卵巢癌的死亡率高居不下，占各類婦科腫瘤的首位[2-3]。目前卵巢癌的發(fā)病機制尚未完全清楚，仍然缺乏病因治療，因此探究卵巢癌的發(fā)病機制和尋找新的治療藥物具有重要的臨床意義[4]。研究發(fā)現，脂類作為身體重要的營養(yǎng)物質，不僅貯存機體所需能量，而且是細胞周期活動中的重要活性分子，參與細胞間信號傳導、細胞炎癥因子浸潤和細胞侵襲等生物學活動，因此，脂質代謝因子異常與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移等越來越受到科研人員的關注[5]。超長鏈脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是ELOVLs家族基因中的第6個成員，主要參與飽和與單不飽和脂肪酸的延伸，是機體內脂肪酸代謝的關鍵調控因子[6]。已有研究報道了ELOVL6基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的重要調控作用[7]。本研究主要研究ELOVL6基因在卵巢漿液性腺癌中的表達以及從分子水平探討其對卵巢癌細胞增殖、侵襲、凋亡的生物學功能影響，從而為深入研究ELOVL6與卵巢漿液性腺癌的發(fā)病機制提供基礎實驗依據。

1 材料及方法

1.1 臨床資料

選取2018年4月至2020年12月在青海省第五人民醫(yī)院行卵巢漿液性腺癌術的80例患者，收集其癌組織，其中高級別漿液性腺癌組織(n=55)，低級別漿液性腺癌組織(n=25)，另收集因其他疾病行切除手術的正常卵巢和輸卵管組織(n=20)。納入標準：① 確診為卵巢漿液性腺癌的患者；② 患者術前未接受放化療等治療；③ 本研究經本院倫理委員會批準，所有參與患者均知情并同意。排除標準：① 合并其他惡性腫瘤；② 患有自身免疫病者。

1.2 細胞及其培養(yǎng)

人卵巢癌SKOV3細胞和OAW28細胞購自中國科學院細胞庫。SKOV3細胞用10%胎牛血清配置的Mc-Coy’s 5A培養(yǎng)基；OAW28細胞用10%胎牛血清配置的RPMI1640培養(yǎng)基；兩種細胞均培養(yǎng)于37℃，5%CO2孵育箱中。

1.3 研究方法

1.3.1 卵巢漿液性腺癌組織中ELOVL6陽性表達率

(1)手術切除患者卵巢病變組織，放入10%福爾馬林中固定24 h，經梯度酒精脫水、二甲苯透明后用石蠟包埋，將蠟塊用切片機切成厚度為4 μm的蠟片，放入45℃～55℃清水的展片機中，待完全展開后將其用載玻片撈起，放入60℃烤箱中烘烤2 h。

(2)蠟片脫蠟后用PBS洗片3次，每次10 min，然后加入3% H2O2溶液孵育10 min，PBS清洗3次，37℃封閉10 min，使抗原位點暴露。

(3)封閉后加入ELOVL6一抗4℃孵育過夜，PBS清洗3次，二抗特異性結合一抗，室溫孵育2 h，PBS清洗3次；滴加DAB顯色液15 min，蘇木素復染1 min，脫水，封片。

(4)在光鏡下觀察，ELOVL6定位于細胞核，出現棕黃色顆粒為陽性細胞，每個切片選取10個高倍視野計算陽性細胞率(陽性細胞率=陽性細胞數/觀察細胞數×100%)，陽性細胞率<10%為0分，10%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分;染色程度：無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。取兩組計分之積:0～3為陰性，4～12為陽性。

1.3.2 ELOVL6轉染后在卵巢癌細胞中mRNA表達以及對卵巢癌細胞生物學功能的影響

(1)細胞分組與轉染

將卵巢癌細胞SKOV3和OAW28分別分成轉染組和對照組，均培養(yǎng)于37℃，5%CO2孵育箱中，轉染前1 d用0.25%胰蛋白酶消化，用50%的細胞密度進行傳代，取對數生長期的細胞按LipofectAMINE 2000轉染試劑說明書進行轉染，將ELOVL6分別轉染至SKOV3和OAW28轉染組細胞，轉染6 h后換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)qRT-PCR驗證轉染前后ELOVL6在卵巢癌細胞中的表達

① SKOV3和OAW28細胞RNA提?。喝∞D染前后SKOV3和OAW28卵巢癌細胞加入1 mL Trizol，室溫放置5 min充分裂解，在EP管中加入200 μL氯仿，渦旋振蕩30 s，室溫靜置2～3 min后，在4℃，10 000 rpm的條件下離心15 min；取上清液至另一EP管，加入500 μL異丙醇，手動搖勻后在室溫條件下靜置10 min，接著4℃，10 000 rpm的條件下離心10 min，撇去上清液，底部沉淀即為RNA；EP管內加入預先冰好的75%乙醇，用手輕彈管底的沉淀，待其浮起后，劇烈震蕩15 s后離心5 min，撇去上清液，將沉淀室溫干燥；加入40 μL的DEPC水，槍頭吹打幾次，使其溶解；吸取2 μL RNA樣品用來檢測其純度，A260/A280的比值一般在1.6～1.8之間，把其余的RNA分裝后保存在-80℃冰箱。

② 逆轉錄合成cDNA：逆轉錄第一鏈cDNA的合成使用反轉錄試劑盒來進行。所有實驗操作過程都嚴格按照說明書來操作。反應體系20 μL，冰上配制反應液。逆轉錄反應條件：37℃ 15 min(反轉錄反應)，85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)，結束后cDNA置 4℃保存。

③ 定量反應：用逆轉錄合成的cDNA作為模板，應用SYBR Green Mix進行實時PCR分析。反應體系為20 μL，實時PCR條件：95℃ 10 min，95℃ 2 s，60℃ 20 s，70℃ 10 s，循環(huán)40次。

④ 相對定量計算：以U6 RNA作為內參照，根據RT-PCR反應結果中的Ct值，采用相對定量的方法比較，ΔCt=平均Ct目的基因-平均Ct管家基因,ΔΔCt=ΔCt實驗樣本-ΔCt對照樣本,相對量=2-ΔΔCt。

(3)MTT觀察轉染后卵巢癌細胞增殖能力

分別將SKOV3和OAW28細胞轉染組和對照組細胞接種于96孔板中，每組設5個復孔，37℃ 5%CO2孵育箱培養(yǎng)12、24、36、48、72 h，每孔加滅菌后的MTT液20 μL,繼續(xù)孵育4 h后取出，加入DMSO微微震蕩溶解，用酶標儀在波長570 nm處測其吸光值(OD)，吸光值越大則細胞增殖能力越強。

(4)Transwell實驗觀察轉染后卵巢癌細胞侵襲能力

將Transwell放入培養(yǎng)板中，在上室加入Matrigel基質膠，37℃ 30 min形成基質膜，然后分別將100 μL轉染組和對照組SKOV3和OAW28細胞接種于Transwell上室，在下室加入500 μL 20% FBS細胞培養(yǎng)液，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用棉簽擦拭上層未遷移的細胞，用PBS清洗下層細胞3次，用福爾馬林固定30 min，適當風干后用0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗，倒置晾干后在光學顯微鏡下取隨機選取5個高倍視野進行細胞計數，數量越多則侵襲能力越強。

(5)流式細胞儀檢測轉染后卵巢癌細胞凋亡能力

分別取對數生長期轉染組和對照組SKOV3、OAW28細胞，經胰蛋白酶消化后，3 000 rpm離心5 min。收集全部細胞至1.5 mL離心管，用PBS緩沖液洗滌2次后，再經3 000 rpm離心5 min，收集細胞，在室溫避光下加入5 μL Annexin V-FITC工作液，孵育10 min后，再加入5 μL PI染色液，在同一環(huán)境下孵育5 min。加入500 μL PBS并輕輕混合，在1 h內通過流式細胞儀進行檢測，激發(fā)波長488 nm，檢測波長675 nm，使用FL1通道進行檢測。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 卵巢漿液性腺癌患者不同級別癌組織中ELOVL6陽性表達率比較

免疫組化結果顯示，ELOVL6在正常卵巢組織中全部呈強陽性表達，而在低級別漿液性腺癌組織中呈弱陽性表達(表達率為44.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常輸卵管組織中ELOVL6陽性表達(表達率為90.00%)相比，ELOVL6在高級別漿液性腺癌組織中陽性表達(表達率為54.55%)顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1(見彩插1)，表1。

表1 不同級別卵巢癌組織中ELOVL6蛋白陽性表達率比較[n(%)]

2.2 驗證ELOVL6轉染前后在卵巢癌細胞SKOV3和OAW28中的表達

qRT-PCR結果顯示，ELOVL6 mRNA在對照組SKOV3和OAW28卵巢癌細胞中呈低表達，成功轉染ELOVL6后，在轉染組其mRNA表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：與對照組相比，*P<0.05圖2 ELOVL6 mRNA在SKOV3和OAW28卵巢癌細胞中的表達

2.3 ELOVL6對SKOV3和OAW28卵巢癌細胞增殖能力的影響

MTT細胞增殖實驗表明，與對照組相比，ELOVL6轉染后可以抑制SKOV3和OAW28卵巢癌細胞的增殖。SKOV3細胞在轉染后培養(yǎng)36 h，其增殖能力較對照組有顯著性下降，差異有統計學意義(P<0.05)，OAW28細胞在轉染后培養(yǎng)48 h，其增殖能力較對照組有明顯的下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

注：與對照組相比，*P<0.05圖3 ELOVL6對卵巢癌細胞增殖能力的影響

2.4 ELOVL6對SKOV3和OAW28卵巢癌細胞侵襲能力的影響

Transwell細胞侵襲實驗表明，ELOVL6轉染后可以抑制卵巢癌細胞的侵襲。SKOV3轉染組細胞穿膜數明顯少于對照組細胞穿膜數[(201±9)個 vs (323±12)個]；OAW28轉染組細胞穿膜數少于對照組細胞穿膜數[(158±4)個 vs (286±2)個]，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：與對照組相比，*P<0.05圖4 ELOVL6對卵巢癌細胞侵襲能力的比較

2.5 ELOVL6對SKOV3和OAW28卵巢癌細胞凋亡能力的影響

通過流式細胞檢測結果發(fā)現，與對照組細胞相比，SKOV3和OAW28轉染組細胞凋亡能力增強，ELOVL6能促進卵巢癌細胞凋亡，見下頁圖5。

注：與對照組相比，**P<0.01圖5 ELOVL6對卵巢癌細胞凋亡能力的影響

3 討論

脂肪是細胞生理學的主要成分，人類可以通過從碳水化合物或蛋白質來源合成脂肪或通過飲食直接攝入獲得脂肪，并通過調節(jié)它們的新陳代謝來維持機體內環(huán)境的平衡，如果這種代謝紊亂則會導致疾病的發(fā)展[8]。長期以來由脂肪堆積引起的肥胖一直被懷疑是誘導癌癥發(fā)生的危險因素，所以有關脂肪代謝與癌癥發(fā)病機制之間的關系一直是學者們關注的重點[9]。事實上，有研究已經指出脂肪堆積為食道癌、結腸癌、子宮癌、腎癌和絕經后乳腺癌的病因，也是前列腺癌、胰腺癌和卵巢癌的重要危險因素[10]。據統計，全世界大約16%～20%的女性和14%的男性癌癥死亡是由肥胖引起的[11]。此外，許多研究表明，有關脂肪合成或脂肪氧化基因的異常表達會造成腫瘤細胞的轉移、治療抵抗和復發(fā)，使得對癌癥患者難以進行靶向治療，增加了癌癥研究的挑戰(zhàn)性[12]。然而，關于脂肪代謝和卵巢癌這兩個生物學過程之間的調節(jié)關系并沒有明確的結論，本研究主要針對ELOVL6對卵巢漿液性腺癌的調控機制進行初步探討，爭取為卵巢癌的臨床治療提供實驗依據。

ELOVL6作為脂肪酸代謝的關鍵調控因子，在催化C12～C16脂肪酸延長反應中起限速作用[13]。有研究報道，棕櫚酸C16在癌細胞的生長和繁殖過程中發(fā)揮著供能的作用，在卵巢癌細胞中棕櫚酸表達顯著升高，當敲除小鼠體內的ELOVL6基因后，可以終止C16向C18轉變的過程，從而抑制癌細胞的增長[14]。體外實驗研究發(fā)現，ELOVL6基因在正常細胞中均呈現高表達，而在癌細胞中其表達水平顯著下降，并且表達水平與細胞分化程度呈正相關；在病理等級分期中I+II期表達水平明顯高于III+Ⅳ期，這就說明ELOVL6與病理發(fā)展等級呈負相關[15]。在本研究中我們分別觀察了卵巢漿液性腺癌患者組織中ELOVL6的陽性表達和卵巢癌細胞SKOV3和OAW28中mRNA表達，發(fā)現在正常組織或細胞中ELOVL6表達顯著，而在卵巢癌組織或細胞中表達水平明顯降低，這與文獻報道結果一致。還有研究發(fā)現，AMPK/mTOR通路是介導細胞增殖、分化和凋亡的關鍵樞紐，ELOVL6可以通過下調細胞周期抑制因子p53和p21來降低mTOR磷酸化，進而干擾腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抑癌的作用[16]。另外，PI3K/AKT通路是調節(jié)脂質代謝和細胞增殖分化的重要通路，通過干擾ELOVL6可以降低AKT磷酸化活性，進而抑制癌細胞的增殖[17]。本研究通過MTT和Transwell觀察到ELOVL6有抑制卵巢癌細胞增殖和遷移的作用，流式檢測結果表明，ELOVL6高表達能促進卵巢癌細胞的凋亡，與文獻報道結果相吻合。

綜上所述，ELOVL6蛋白與卵巢癌的發(fā)生密切相關，其在卵巢癌組織中呈弱陽性表達，恢復ELOVL6表達水平，可以抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，促進癌細胞凋亡，為臨床治療卵巢癌提供理論依據。但本研究只選擇了卵巢漿液性腺癌這一種病理亞型，研究范圍較窄，且樣本數量較少，在后續(xù)研究中還需擴大樣本數量，選擇多種卵巢癌病理類型，以期更深入的闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。