QuEChERS結(jié)合UHPLC-MS/MS法測定半夏露顆粒中4種麻黃堿類成分

晏亮 丁銀平 陳偉康 劉德鴻 李晶

關(guān)鍵詞半夏露顆粒;麻黃堿類成分;QuEChERS方法;超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法;含量測定

半夏露顆粒是由生半夏、枇杷葉、遠(yuǎn)志（泡）、款冬花、桔梗、麻黃、甘草、陳皮和薄荷油9 味中藥制成的復(fù)方制劑，具有止咳化痰的功效，用于咳嗽多痰、支氣管炎的臨床治療[1]。半夏露顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除性狀和顆粒劑通用制劑要求外，僅有針對薄荷腦的薄層色譜鑒別方法[1]。麻黃為方中臣藥，具宣肺平喘作用，主要含有麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、去甲偽麻黃堿等麻黃堿類成分，以上4 種成分均為半夏露顆粒的有效成分[2-3]。麻黃堿類成分腎上腺素受體活性很強(qiáng)，尤其是去甲偽麻黃堿對腎上腺素受體的半數(shù)效應(yīng)濃度（median effectiveconcentration，EC50）為0.015 μmol/L[4]，濃度過高可引發(fā)血壓升高、震顫、焦慮、失眠、頭痛、心悸等嚴(yán)重不良反應(yīng)[5-6]。因此，建立以麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、去甲偽麻黃堿為代表的麻黃堿類成分含量測定方法對半夏露顆粒的療效與安全性研究至關(guān)重要。筆者通過檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)大多僅測定了麻黃或其復(fù)方制劑中2～3 個(gè)麻黃堿類成分[7-11]，不能全面地評價(jià)含麻黃類藥物的療效與安全性。目前測定方法大多為高效液相色譜法[7-11]，但加大取樣量、液液萃取前處理結(jié)合高效液相色譜法檢測，難以達(dá)到預(yù)期的檢測效果。

QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）是一種分散固體萃取技術(shù)，具有提取效率高、凈化效果好的優(yōu)點(diǎn)[12]。該方法被廣泛應(yīng)用于食品農(nóng)藥殘留和功效成分檢測前處理領(lǐng)域[12-17]?；诖耍狙芯渴状我訯uEChERS方法對樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra high performance liquidchromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）法同時(shí)測定半夏露顆粒中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、去甲偽麻黃堿4 種麻黃堿類成分的含量，旨在為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和質(zhì)量安全控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1290 型快速液相色譜儀（美國Agilent 公司），API 4000 型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Applied Biosystems 公司），VORTEX WX型渦旋混合器（意大利VELP 公司），ST16R 型離心機(jī)、MicroPure UV/UF 型超純水系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），KQ500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XS205DU型電子天平、ML204 型電子天平（瑞士MettlerToledo公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

半夏露顆粒共3 批，其中樣品1（批號191003088）購自同藥集團(tuán)大同制藥有限公司，樣品2（批號21032701）購自云南裕豐藥業(yè)有限公司，樣品3（批號190314）購自廣西雙蟻藥業(yè)有限公司。生半夏飲片（批號ST210201）購自貴州締誼健康制藥有限公司;遠(yuǎn)志飲片（批號2001027）、陳皮飲片（批號2001026）均購自安徽盛海堂中藥飲片有限公司;桔梗飲片（批號200218）購自江西江中中藥飲片有限公司;甘草飲片（批號170901）購自江西博源堂藥業(yè)有限公司;款冬花飲片（批號190202171）、枇杷葉飲片（批號180804791）均購自康美藥業(yè)股份有限公司;薄荷藥材（批號20170915）產(chǎn)自江蘇省泗洪縣;以上飲片/藥材均經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院丁銀平主管中藥師檢驗(yàn)為真品。薄荷油為上述薄荷藥材經(jīng)揮發(fā)油提取法提取制得。

鹽酸麻黃堿對照品（批號171241-201508，純度99.8%）、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號171237-201208，純度99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸去甲偽麻黃堿對照品溶液（批號CX171206-20，質(zhì)量濃度100μg/mL，供含量測定用）、鹽酸甲基麻黃堿對照品溶液（批號CL180312-04，質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，供含量測定用）均購自美國Stanford Chemicals 公司;乙酸銨、甲酸、乙腈、甲醇均購自德國Sigma 公司，均為色譜純;氯化鈉（NaCl，分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;十八烷基鍵合硅膠吸附劑（octadecyl bonded silica gel adsorbent，以下簡稱“C18”;粒徑50 μm）、N-丙基乙二胺吸附劑（N-propyl ethylenediamine adsorbent，PSA;粒徑40～63μm）均購自日本Shimadzu 公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品儲備液精密稱取鹽酸麻黃堿對照品10.54 mg、鹽酸偽麻黃堿對照品10.80 mg，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品儲備液;精密吸取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品儲備液各10 mL，鹽酸去甲偽麻黃堿對照品溶液1.0 mL、鹽酸甲基麻黃堿對照品溶液0.3 mL置于同一25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成含麻黃堿34.470 μg/mL、偽麻黃堿35.355 μg/mL、去甲偽麻黃堿3.223 μg/mL、甲基麻黃堿9.972 μg/mL（上述含量均由鹽酸鹽折算成麻黃堿類成分計(jì)）的混合對照品儲備液，于-20 ℃密封貯存，備用。

2.1.2 供試品溶液取本品適量，研細(xì)，取粉末約0.2 g，精密稱定，置于50 mL離心管中，加入含1%甲酸的甲醇10 mL，渦旋30 s，超聲（功率250 W，頻率25 kHz）提取20 min，加入無水硫酸鈉4 g，渦旋30 s后，以10 000 r/min離心5 min，精密吸取上清液2 mL置于10 mL量瓶中，加含1%甲酸的甲醇至刻度，搖勻，制得待凈化液。將上述待凈化液1 mL轉(zhuǎn)移至2 mL QuEChERS 凈化管（含PSA100 mg、C18 50 mg）中，渦旋30 s，以10 000 r/min 離心1min，取上清液過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 缺麻黃陰性樣品溶液按半夏露顆粒處方信息[1]，按工藝制法制成缺麻黃陰性樣品。取缺麻黃陰性樣品適量，研細(xì)，取粉末約0.2 g，精密稱定，其余同“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，制得缺麻黃陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 以Agilent XDB-C1（8 4.6 mm×50 mm，1.8 μm）為色譜柱，以5 mmol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動相A、乙腈為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫（0～13min，4%B;13～14 min，4%B→90%B;14～16 min，90%B;16～17 min，90%B→4%B;17～22 min，4%B）;流速為0.40 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子化源，以多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行正離子掃描;氣簾氣壓力為20.0 psi;離子源氣體1 壓力為60.0psi;離子源氣體2 壓力為55.0 psi;碰撞氣壓力為6 psi;噴霧電壓為5 500 V;離子源氣體溫度為450.0 ℃。具體離子對檢測條件見表1。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液1 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制得混合對照使用液。精密吸取該混合對照使用液1 mL，置10 mL 量瓶中，加含1%甲酸的甲醇定容，制得混合對照品溶液。取上述混合對照品溶液（含麻黃堿137.88 ng/mL、偽麻黃堿141.42 ng/mL、去甲偽麻黃堿12.89 ng/mL、甲基麻黃堿39.89 ng/mL）、供試品溶液和缺麻黃陰性樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄典型MRM 色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，4 種麻黃堿類成分色譜峰峰形良好，同分異構(gòu)體麻黃堿與偽麻黃堿能有效分離，陰性樣品無干擾，表明該方法具有良好的專屬性。

2.4 線性關(guān)系、檢查限和定量限考察

精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對照使用液，用含1%甲酸的甲醇稀釋，制成含麻黃堿1.38、2.76、6.89、13.79、27.58、68.94、137.88、165.46、206.82 ng/mL，偽麻黃堿1.41、2.83、7.07、14.14、28.28、70.71、141.42、169.70、212.13 ng/mL，去甲偽麻黃堿1.29、2.58、6.45、12.89、15.47、19.34 ng/mL，甲基麻黃堿1.99、3.99、7.98、19.95、39.89、47.87、59.83 ng/mL的系列工作溶液。取上述系列工作溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，以各待測成分峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸;以信噪比3 ∶1 確定檢測限，以信噪比10 ∶1 確定定量限。結(jié)果顯示，麻黃堿等4種成分在各自檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系均良好（r>0.99），詳見表2。

2.5 精密度考察

取“2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，麻黃堿、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、甲基麻黃堿峰面積的RSD分別為0.4%、0.3%、0.5%、0.4%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取半夏露顆粒樣品（批號191003088），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在25 ℃下放置0、2、4、8、12、24、48 h 時(shí)按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，麻黃堿、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、甲基麻黃堿峰面積的RSD 分別為0.9%、0.8%、1.4%、1.1%（n=7），表明供試品溶液在25 ℃下放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性考察

取半夏露顆粒樣品（批號191003088），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，共6 份，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，麻黃堿、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、甲基麻黃堿含量的RSD分別為1.0%、0.9%、1.3%、1.5%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率考察

分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液（含麻黃堿34.470 μg/mL、偽麻黃堿35.355 μg/mL、去甲偽麻黃堿3.223 μg/mL、甲基麻黃堿9.972 μg/mL）0.2、0.4、0.6mL，分別置于50 mL量瓶中，加含1%甲酸的甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。精密稱取已知含量的半夏露顆粒樣品（批號191003088）9 份，每份約0.1 g，分別精密加入上述低、中、高質(zhì)量濃度混合對照品溶液10 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為99.13%、100.87%、98.45%、95.75%，RSD分別為1.1%、1.2%、1.0%、1.7%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表3。

2.9 樣品測定

取半夏露顆粒樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備2 份，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，麻黃堿、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、甲基麻黃堿的含量分別為20.62～26.02、20.96～24.90、2.26～2.63、5.36～6.32 μg/g，詳見表4。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本課題組前期考察了乙腈、甲醇、含1%甲酸的乙腈、含1%甲酸的甲醇對半夏露顆粒中4 種麻黃堿類成分的提取情況。結(jié)果顯示，含1%甲酸的甲醇的提取效果好、回收率高且共提物較少，故將其作為提取溶劑。麻黃堿類成分作為小分子生物堿，極性大、堿性強(qiáng)，在極性較大的甲醇中的溶解性更優(yōu)，而甲酸的加入將更有利于堿性物質(zhì)的提取;此外，無水硫酸鈉可去除基質(zhì)中的水分，并可起到一定的蛋白鹽析沉淀效果。

3.2 凈化條件的選擇

半夏露顆粒是由各藥材經(jīng)清炒、滲漉、煎煮等流程，將所得清膏與10 倍量的蔗糖拌勻后所制，成分復(fù)雜且含糖量較大。本課題組前期嘗試用甲醇直接超聲提取不作前處理，但所得供試品溶液顏色較深且含有大量雜質(zhì)，多次進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)譜離子源錐孔處存在明顯污染。雖然，串聯(lián)質(zhì)譜以MRM模式的專屬性較好，雜質(zhì)不出峰，但長期分析未經(jīng)凈化的樣品，會造成質(zhì)譜對待測物的響應(yīng)減弱，影響測定的準(zhǔn)確度[17]。研究指出，QuEChERS 中的PSA 可通過氫鍵作用而除去糖、色素、有機(jī)酸等成分，C18則可有效去除油脂、甾醇等小極性化合物[18-19]。本課題組實(shí)踐結(jié)果顯示，QuEChERS前處理方法可以有效凈化供試品溶液，將棕褐色的甲醇提取液凈化成澄清近無色的液體，除去了大量雜質(zhì)，有利于減少質(zhì)譜離子源所受污染，提高檢測的準(zhǔn)確度。本課題組通過優(yōu)化PSA 和C18的用量發(fā)現(xiàn)，采用PSA 100 mg、C18 50mg凈化4 種麻黃堿類成分的平均回收率最高，提取凈化效果最優(yōu)，所得供試品溶液澄清近無色，故選用該組合作為本研究所用的QuEChERS凈化劑。

3.3 色譜、質(zhì)譜條件的選擇

4種麻黃堿類成分均為小分子強(qiáng)堿性物質(zhì)，且麻黃堿與偽麻黃堿為一組同分異構(gòu)體，兩者的一級母離子與二級碎片離子完全相同，須通過適當(dāng)?shù)纳V條件進(jìn)行有效分離。本課題組通過對Phenomenon Luna C18（2.0 mm×150 mm，3 μm）、Agilent XDB C1（8 4.6 mm×50 mm，1.8 μm）2 種色譜柱的分離情況進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，Agilent XDB C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）對4 種待測成分有很好的保留和分離效果。本課題組根據(jù)色譜圖比較不同流動相體系的分離效果發(fā)現(xiàn)，添加乙酸銨可改善色譜峰峰形，添加甲酸可增強(qiáng)4 種麻黃堿類成分的離子化效果和質(zhì)譜響應(yīng)，最終采用5 mmol/mL 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作為流動相體系。此外，本課題組還優(yōu)化了離子源的電氣參數(shù)、解簇電壓、裂解電壓等質(zhì)譜參數(shù)，流動相梯度、流速、柱溫、進(jìn)樣量等色譜參數(shù)，最終得到了響應(yīng)較強(qiáng)、分析時(shí)間較短、色譜峰峰形較好的質(zhì)譜與色譜條件。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS方法凈化供試品溶液，采用UHPLC-MS/MS法在22 min 內(nèi)同時(shí)測定了半夏露顆粒中4 種麻黃堿類成分的含量，所用樣品前處理方法簡便，定量分析方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析成本低且檢測結(jié)果可靠。相比直接經(jīng)甲醇提取后進(jìn)樣分析，本法有效地減少了質(zhì)譜離子源污染，適用于大量樣品的快速分析，并可為成分復(fù)雜的中藥成方制劑質(zhì)譜分析和質(zhì)量控制提供一定的參考。