環(huán)糊精修飾的氟苯尼考PLGA納米粒的制備及其體外釋放評(píng)價(jià)

何怡嬌，李姝琪，高崇凱，易 軍，李曉芳，吳 芳，林博璇，鄧 洵，黃智龍，郭波紅*

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；2.廣東潤(rùn)華藥業(yè)有限公司，廣東 揭陽(yáng) 515500)

氟苯尼考(florfenicol, FF)是一種硫代苯酚的氟化物類(lèi)似物，是一種對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌均有效的廣譜獸用抗生素，具有無(wú)潛在再生障礙性貧血作用等優(yōu)點(diǎn)[1]，被廣泛應(yīng)用。但是，F(xiàn)F的水溶性差，生物利用度低，血漿半衰期縮短，給藥后迅速釋放，這些缺點(diǎn)給臨床應(yīng)用帶來(lái)很多不便[2-3]。因此，采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作為載體材料來(lái)改善氟苯尼考成藥性缺陷，PLGA納米?？梢蕴岣咚幬镌隗w內(nèi)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物體內(nèi)作用時(shí)間，減小藥物的副作用，提高藥物溶解度和生物利用度。

因材料本身的局限性，單一的納米載體材料往往會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定性較差，突釋效果明顯，靶向作用較弱等缺點(diǎn)[4]。將親水性包覆材料與疏水性納米材料相結(jié)合可避免這種缺點(diǎn)，疏水性的納米材料作為內(nèi)核可以裝載藥物，提升藥物的溶解度，親水性物質(zhì)進(jìn)行包覆的外層可保護(hù)內(nèi)部的藥物，可以延長(zhǎng)藥物半衰期，控制藥物的釋放，提高藥效以達(dá)到期望的治療效果[5-7]。環(huán)糊精(Cyclodextrins, CDs)是一種外表面親水、內(nèi)腔疏水的環(huán)狀低聚糖，可通過(guò)疏水側(cè)鏈與藥物相互作用形成包合物，從而提高藥物的溶解度[8]。它與PLGA結(jié)合形成的共聚物，可以減少初始爆破釋放，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的停留時(shí)間來(lái)達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的目的，通過(guò)不斷釋放活性物質(zhì)發(fā)揮藥物儲(chǔ)層的作用，提高親水性和穩(wěn)定性，可以提高其載藥能力來(lái)提高藥效，顯示出在藥物輸送系統(tǒng)方面的巨大潛力[9-11]。

選用生物相容性好的PLGA作為制備納米粒的載體材料，采用親水性包覆材料2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-HP-β-CD)對(duì)納米粒進(jìn)行修飾，利用簡(jiǎn)單易行的乳化溶劑揮發(fā)法，單因素試驗(yàn)考察及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs，并研究2-HP-β-CD對(duì)納米粒粒徑與電位、包封率、體外釋放等的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；KQ2200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PRACTUM124-1CN電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DelsaTM Nano C 粒徑分析儀(美國(guó) Beckman Coulter公司)；PKZ-1電熱恒溫振蕩水槽(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 FF原粉(99.50%，山東國(guó)邦藥業(yè)股份有限公司)；FF 對(duì)照品 (含量 99. 90 %，批號(hào): K0301703，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，LA/GA=50/50，相對(duì)分子量：10000/20000；LA/GA=75/25，相對(duì)分子量：10000/20000，山東省醫(yī)療器械研究所)；聚乙烯醇(PVA，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)；2-HP-β-CD(美國(guó)Sigma Aldrich公司)；葡聚糖凝膠(Sephadex G-50，北京索萊寶科技有限公司)；透析袋，MWCO：8000～14000(廣州市齊云生物技術(shù)有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，Dikma公司)；二氯甲烷、丙酮(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的制備 采用改進(jìn)的乳化-溶劑揮發(fā)法[12]，精密稱(chēng)取一定量的FF和PLGA，溶解于適量的丙酮：二氯甲烷(3:2)的混合溶劑中構(gòu)成有機(jī)相，探頭超聲(超聲功率為380 W)作用下將上述溶液緩慢滴加到含有PVA和2-HP-β-CD的水相中，繼續(xù)超聲一定時(shí)間得白色乳液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，然后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)膜整粒，即得FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs。

1.4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制備工藝的單因素試驗(yàn)

1.4.1 乳化劑濃度篩選 固定其他制備條件保持不變，改變處方中的PVA濃度，將PVA濃度依次設(shè)置為1%，2%，3%，4%，根據(jù)“1.3”項(xiàng)下制備方法，測(cè)定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情況。

1.4.2 藥脂比篩選 固定其他制備條件保持不變，改變藥脂比分別為1∶2，1∶5，1∶10，1∶20，根據(jù)“1.3”項(xiàng)下制備方法，測(cè)定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率的情況。

1.4.3 藥物濃度篩選 固定其他制備條件保持不變，改變處方中FF濃度依次為1.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，根據(jù)“1.3”項(xiàng)下制備方法，測(cè)定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情況。

1.4.4 2-HP-β-CD濃度篩選 固定其他制備條件保持不變，改變處方中2-HP-β-CD濃度依次為1%，1.5%，2%，2.5%，根據(jù)“1.3”項(xiàng)下制備方法，測(cè)定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情況。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)之上，本試驗(yàn)選取PVA濃度(A)，藥物與PLGA用量比(B)，F(xiàn)F濃度(C)，2-HP-β-CD濃度(D)四個(gè)因素，固定有機(jī)相與水相體積比為1∶8，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)選出FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制備處方。

表1 正交試驗(yàn)水平因素表Tab 1 Orthogonal test level factors table

1.6 FF含量測(cè)定

1.6.1 色譜條件 色譜柱：DIKMA Diamonsil?C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水=35∶65(V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.6.2 方法學(xué)考察 精密稱(chēng)定干燥的FF對(duì)照品適量置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相配制成濃度為500 μg·mL-1的FF對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取FF對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋配制成為10、30、50、80、100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析測(cè)定(進(jìn)樣經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾)。配制低、中、高濃度FF對(duì)照溶液，一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定 6 次，連續(xù)測(cè)定 3 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度及 RSD值，另取空白納米粒分別加入低、中、高濃度FF對(duì)照溶液，加適量乙腈充分振搖破乳， 用流動(dòng)相定容后經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.7 包封率測(cè)定方法 精密吸取FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs膠體溶液0.5 mL，加樣于Sephadex G-50柱(1.3 cm×25 cm)，用蒸餾水洗脫，棄去前10 mL，收集游離藥物部分20 mL，60 ℃水浴揮干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，定容至10 mL，微孔濾膜過(guò)濾后取20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算W游離。另取0.5 mL置10 mL量瓶中，加入適量乙腈充分振搖破乳，用流動(dòng)相定容，微孔濾膜過(guò)濾后取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算W總，計(jì)算FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率。

包封率=(1-W游離/W總)×100%

W總：總藥物量，W游離：游離藥物量

1.8 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒徑與Zeta電位觀察與測(cè)定 取適量FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs膠體溶液置于DelsaTM Nano C激光粒度分析儀，測(cè)定粒徑，多分散指數(shù)(polydispersity index, PDI)和Zeta電位。

1.9 體外釋放行為研究 體外釋放研究在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH7.4)中通過(guò)透析法進(jìn)行[13]，具體方法如下：將含有游離FF或FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs(相當(dāng)于FF 2 mg)的樣品溶液加入截留分子量為8000～14000的透析袋中，將透析袋兩端密封，放入含有PBS釋放介質(zhì)的錐形瓶中，并放入電熱恒溫振蕩水槽中37 ℃恒溫振蕩。按預(yù)定的時(shí)間間隔，吸取2 mL釋放介質(zhì)按照“1.6.1”方法進(jìn)行分析，并添加2 mL新鮮PBS緩沖液。測(cè)定FF累積釋放量，并且計(jì)算累積釋放率。結(jié)果一式三份，以累積釋藥百分率(%)為縱坐標(biāo)對(duì)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)作圖。

為進(jìn)一步闡明FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的釋藥特性，對(duì)FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi 方程、Ritger-peppas方程和Weibull方程進(jìn)行擬合。具體方程如下：

零級(jí)級(jí)動(dòng)力學(xué)方程:Q=Kt

一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程:ln(1-Q)=-Kt/2.303+lnM

Higuchi方程:Q=Kt1/2

Ritger-peppas方程:Q=Ktn

Weibull方程:lnln(1/(1-Q/100))=mlnt-lnt0

其中Q為累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)，K為釋放速率常數(shù)，t為時(shí)間，M為常數(shù)，n為擴(kuò)散系數(shù)，m為形狀參數(shù)，t0為尺寸參數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化劑濃度篩選 結(jié)果表明，當(dāng)PVA濃度由1%增加到2%時(shí)，納米粒的包封率由37.23%逐漸升高至61.07%，但繼續(xù)增加PVA濃度至4%時(shí)，其包封率下降至36.48%。原因可能是在一定范圍內(nèi)PVA濃度的升高提升了乳化效果，使納米粒產(chǎn)率增加；但當(dāng)PVA濃度繼續(xù)增大，會(huì)使藥物更容易擴(kuò)散到水相，致使包封率開(kāi)始下降。因此可選擇PVA濃度范圍為1.5%～2.5%。

2.2 藥脂比篩選 結(jié)果表明，當(dāng)藥脂比由1∶2增加至1∶10時(shí)，納米粒的包封率由29.48%逐漸升高至59.75%，但繼續(xù)增加藥脂比至1∶20時(shí)，其包封率下降至53.75%可能是當(dāng)PLGA濃度逐漸提高時(shí)，納米粒的產(chǎn)率也逐漸增加，使包封率提高；其濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致膠體溶液黏度過(guò)高，形成團(tuán)聚，導(dǎo)致包封率減小。因此可選擇藥脂比范圍為1∶10～1∶20。

2.3 藥物濃度篩選 結(jié)果表明，隨著藥物濃度由1.0 mg·mL-1增加至1.5 mg·mL-1時(shí)，納米粒的包封率由43.39%升高至64.47%，但當(dāng)繼續(xù)增加藥物濃度至2.5 mg·mL-1時(shí)，其包封率下降至35.25%。原因可能是當(dāng)藥物濃度較小時(shí)，溶液中藥物含量低，不利于藥物被包封。隨著藥物濃度的升高，溶液藥物含量也逐漸增大，包封率也隨之逐漸升高。但當(dāng)藥物濃度超過(guò)一定量之后，有機(jī)相的黏度也增大，在水中難以分散，導(dǎo)致包封率下降。因此選擇藥物濃度范圍為1.0-2.0 mg·mL-1。

2.4 2-HP-β-CD濃度篩選 結(jié)果表明，隨著2-HP-β-CD濃度由1.0%升高至2.5%時(shí)，F(xiàn)F-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率呈逐漸下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)FF為一定濃度時(shí)，2-HP-β-CD的存在有利于提高FF的溶解度，使其更容易向水相中分散，而難以被疏水性的PLGA包封。因此選擇2-HP-β-CD濃度范圍為1%～1.5%。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，藥脂比對(duì)包封率影響最為顯著，其次為PVA濃度，而藥物濃度對(duì)包封率影響相對(duì)較小，4個(gè)因素對(duì)包封率的影響程度由大至小可排列為：B>A>D>C。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析表Tab 2 Orthogonal test results and visual analysis table

進(jìn)一步將影響因素最小的C組作為誤差組進(jìn)行方差分析(表3)，發(fā)現(xiàn)B因素不同水平間存在顯著性差異(P<0.05)，為主要影響因素；A、D因素不存在顯著性影響，為次要影響因素。綜合直觀分析與方差分析結(jié)果，本試驗(yàn)確定最優(yōu)處方為A2B3C2D3，即處方中PVA濃度2%，藥物與PLGA用量比1∶15，藥物濃度2.0 mg·mL-1，2-HP-β-CD

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Tab 3 Analysis of variance of orthogonal test design

濃度為1.5%。按上述最優(yōu)處方制備3批樣品FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs，并以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照“1.7”項(xiàng)下的包封率測(cè)定方法，測(cè)得平均包封率為(82.02 ± 0.82)%，說(shuō)明處方的重現(xiàn)性較好且工藝穩(wěn)定可行。

2.6 FF含量測(cè)定結(jié)果 以峰面積(A)對(duì)濃度(C, μg·mL-1)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性擬合回歸方程：A=41.211 C+1.553，其中r=0.9999。根據(jù)數(shù)據(jù)說(shuō)明FF在10 μg·mL-1～100 μg·mL-1濃度內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。方法學(xué)考察表明：在本色譜條件下，高中低三種濃度溶液的平均回收率為99.96%，RSD為0.52% (n=9)，日內(nèi)精密度RSD=0.73%(n=6)，日間精密度的RSD=0.27% (n=3)，均符合測(cè)定要求。

2.7 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒徑與Zeta電位觀察與測(cè)定 根據(jù)DelsaTM Nano C激光粒度分析儀的測(cè)定，F(xiàn)F-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒徑為(185.90 ± 2.80) nm(圖1A)，PDI值為0.10 ± 0.05，Zeta電位為(-5.92 ± 1.80) mV(圖1B)，其電位為負(fù)值，可能與粒子表面的環(huán)糊精上的羥丙基有關(guān)。其外貌形態(tài)如圖1A所示，表現(xiàn)為半透明乳光狀溶液。

圖1 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs 外貌，粒徑及電位(A為粒徑，B為電位)Fig 1 FF-2-HP-β-CD-PLGANPs appearance, particle size and potential (A is particle size, B is potential)

2.8 體外釋放行為的研究 體外釋放研究在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH值7.4)中通過(guò)透析法進(jìn)行，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)F的累積釋放率遠(yuǎn)高于FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs組，約4 h即可完全釋放，而FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs組4小時(shí)內(nèi)僅釋放(37.85±1.36)%，F(xiàn)F-2-HP-β-CD-PLGA NPs的釋放速率明顯較FF慢且平穩(wěn)(P<0.05)。后期可持續(xù)平穩(wěn)釋放至72 h，其累積釋放率為(82.08±1.71)%。說(shuō)明2-HP-β-CD的加入可作為納米粒的保護(hù)層，阻礙了FF從內(nèi)核向外擴(kuò)散，有助于藥物的緩慢釋放。

圖2 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs體外釋放曲線(xiàn)Fig 2 FF-2-HP-β-CD-PLGANPs In Vitro Release Profile

體外釋放擬合方程結(jié)果如表4所示，根據(jù)其相關(guān)系數(shù)判斷，F(xiàn)F-2-HP-β-CD-PLGA NPs擬合效果最符合Ritger-peppas方程，擬合方程為lnQ=0.417lnt+2.794，R2=0.9655，其中n=0.32(<0.5)，屬于Fick擴(kuò)散控制藥物釋放。

表4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPS的體外釋放擬合方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Fitting equation and correlation coefficient of in vitro release of FF-2-HP-β-CD-PLGANPS

3 討論與結(jié)論

3.1 包封率測(cè)定方法的選定 本文采用改進(jìn)的乳化-溶劑揮發(fā)法，以PLGA作為載體材料，PVA為乳化劑，脂溶性氟苯尼考為模型藥物，利用2-HP-β-CD對(duì)其進(jìn)行修飾，以包封率作為評(píng)價(jià)納米粒制備工藝的主要指標(biāo)，選用合適的方法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。包封率常用的方法有透析法，低溫高速離心法、超濾法、微柱離心法、葡聚糖凝膠柱色譜法[14]等。采用葡聚糖凝膠柱色譜法，此法利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖凝膠的分子篩作用，可將納米粒膠體溶液中的大分子量納米粒與小分子量游離藥物完全分離。

3.2 PLGA種類(lèi)對(duì)包封率的影響 試驗(yàn)前期，本文首先考察了PLGA種類(lèi)對(duì)FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的影響，分別選用LA/GA為50/50與75/25，分子量分別為10000與20000的PLGA制備納米粒，結(jié)果當(dāng)LA/GA比值相同時(shí)，分子量越大，包封率越高[15]。當(dāng)分子量較高時(shí)(分子量：20000)，提高LA的比例，會(huì)使體系黏度過(guò)高，反而不利于藥物的包封，導(dǎo)致包封率降低，因此本文選用LA/GA為50/50，分子量為20000的PLGA進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

3.3 2-HP-β-CD加入方法對(duì)包封率的影響 在前面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察了2-HP-β-CD的加入方法對(duì)包封率的影響。方法1：先制備FF/2-HP-β-CD包合物，再與乳化劑混合作為水相[16]；方法2：將2-HP-β-CD直接加入含有乳化劑的水相中混勻。結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法2制備的納米粒包封率較高，可能的原因是2-HP-β-CD與乳化劑的共同作用，提高了體系的穩(wěn)定性和包封率[17]。方法1中FF進(jìn)入環(huán)糊精內(nèi)腔形成包合物后，增強(qiáng)了FF在水中的分散性，難以進(jìn)入疏水性載體材料中，造成其包封率偏低。隨著2-HP-β-CD濃度的升高，F(xiàn)F-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率呈逐漸下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)體系中FF為一定量時(shí)，2-HP-β-CD的存在起到了助溶作用，用量越高，助溶效果越好，使其更容易向水相中分散[8]。

3.4 體外釋放結(jié)果 體外釋放結(jié)果表明FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs較FF原藥有明顯的緩釋作用，且可持高濃度平穩(wěn)釋放?？赡苁怯捎诩{米粒外層有2-HP-β-CD的保護(hù)，所以FF沒(méi)有那么快從孔道中釋放出來(lái)，這與文獻(xiàn)中描述結(jié)果相符[18]。所以當(dāng)載體材料表面包覆一層親水性物質(zhì)如2-HP-β-CD，可以避免納米粒子的吸附或降解，延長(zhǎng)了藥物的循環(huán)時(shí)間，提高藥物的溶解度與穩(wěn)定性，控制藥物的釋放，達(dá)到更好的治療效果。

3.5 結(jié)論 本試驗(yàn)選用親水性材料環(huán)糊精修飾氟苯尼考PLGA納米粒，通過(guò)單因素試驗(yàn)，正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選出最優(yōu)處方為：PVA濃度2%，藥物與PLGA用量比1∶15，藥物濃度2.0 mg·mL-1，2-HP-β-CD濃度為1.5%。該處方制備的納米粒的平均包封率為(82.02±0.82)%，體外釋藥具有緩釋行為。