中獸藥參黃顆粒的制備工藝優(yōu)化研究

柯群華，呂亞楠，彭 晶，吳雪琴，嚴(yán)作廷，王勝義*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

母豬圍產(chǎn)期常會(huì)表現(xiàn)出一系列的癥候群，主要包括母豬產(chǎn)前產(chǎn)后便秘、不食，母豬產(chǎn)程長(zhǎng)，母豬產(chǎn)后癱瘓、缺乳、奶水質(zhì)量差，產(chǎn)后不發(fā)情等[1-2]。依據(jù)中獸醫(yī)辨證理論，“氣血虧虛”是母豬分娩前后的主要問(wèn)題，也是影響產(chǎn)仔數(shù)和仔豬成活率的核心因素。因此，母豬分娩前后的保健主要圍繞“氣血”進(jìn)行。參黃顆粒是針對(duì)母豬氣血兩虛研制的中獸藥。固體制劑具有穩(wěn)定性好、體積小，攜帶方便，易于獸用臨床應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)加入矯味劑，可以明顯改善藥物口感。顆粒劑臨床使用、運(yùn)輸便捷，性狀穩(wěn)定，都極大的優(yōu)于合劑[3-4]。中藥顆粒劑的制備一般要經(jīng)過(guò)中藥材提取、分離純化和濃縮、輔料的選擇及制粒成型等過(guò)程，處理方式往往會(huì)因方劑的不同而有所差異，故中藥顆粒劑制備工藝的優(yōu)化要從藥材的性質(zhì)、提取溶劑的種類(lèi)、成型工藝的特點(diǎn)等多個(gè)方面進(jìn)行考慮。試驗(yàn)依據(jù)藥材的性質(zhì)采用水煎煮并冷凝回流工藝進(jìn)行提取、真空冷凍濃縮干燥，并采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)參黃顆粒劑敷料配比工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)選出成型工藝，為處方臨床大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 中藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠)，DHG—9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海鴻都電子科技有限公司)；Waters2695高效液相色譜儀(Waters公司); AL104電子天平(梅特勒有限公司)；KQ5200DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；電熱套(上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司)；SCIENT2—10 N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑 黨參、熟地黃和陳皮等中藥飲片均購(gòu)自黃河中藥材市場(chǎng)，無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201617，含量以96.1%計(jì))，可溶性淀粉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190618)，蔗糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190617)，糊精(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：F1904115)。

甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20181030)為優(yōu)級(jí)純。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝設(shè)計(jì)

1.2.1.1 正交實(shí)驗(yàn)： 采用L9(34)因素水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)參黃顆粒提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。以料液比(A)、提取次數(shù)(B)和提取時(shí)間(C)作為考察因素，每因素分設(shè)3個(gè)水平[5]。以橙皮苷含量、浸膏率作為考察指標(biāo)，因素水平安排見(jiàn)表1。

表1 工藝因素水平設(shè)計(jì)表Tab 1 Design table of process factor level

按照處方比例分別稱(chēng)取黨參、熟地、麥冬、茯苓、白術(shù)、木香、陳皮和甘草，共9份(每份100 g)。按照表1所示，依次以水為溶媒加熱冷凝回流提取、過(guò)濾合并濾液，80 ℃濃縮，定容至100 ml，測(cè)定各樣品中橙皮苷含量；精確量取各提取液60 ml，轉(zhuǎn)入干燥至恒重的蒸發(fā)皿中水浴蒸干處理，轉(zhuǎn)移至干燥箱中，100 ℃干燥4 h，于干燥箱中冷卻至室溫后迅速稱(chēng)重；最后計(jì)算得出膏率(總干膏/藥材總質(zhì)量×100%)，重復(fù)三次。

1.2.2 干浸膏粉的制備 在確定最佳提取工藝后，根據(jù)散劑處方準(zhǔn)確稱(chēng)取中藥飲片，適當(dāng)粉碎后，放入大容量圓底燒瓶中，冷凝回流提取，藥材質(zhì)量9倍的水，回流提取3次，每次提取時(shí)間1 h，提取完成后，雙層紗布過(guò)濾藥渣，合并提取液。將所有濾液常壓濃縮到粘稠狀，之后分裝于冷凍干燥托盤(pán)中，放置于-80 ℃冰箱冷凍6 h，后放入冷凍減壓(≤-40 ℃，0.1 pa)干燥機(jī)中干燥，干燥后的浸膏劑進(jìn)行粉碎，備用[6]。

1.2.3 輔料的篩選 輔料和藥物的配比以及輔料的種類(lèi)是影響顆粒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，根據(jù) 2020 年《中國(guó)獸藥典》第二部(附錄8)中的要求，輔料量一般不超過(guò)藥物量的2倍，因此，試驗(yàn)選擇藥物和輔料的配比為3∶4。輔料種類(lèi)是影響制粒成型的重要因素，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇可溶性淀粉、糊精和蔗糖作為制粒輔料，干浸膏粉與輔料的配比見(jiàn)表2。

表2 不同處方顆粒劑配方表(份)Tab 2 Formula table of Different prescription Granules (copies)

1.2.4 濕法制粒 按處方準(zhǔn)確稱(chēng)取藥物(干浸膏粉)和輔料，混合均勻，使用乙醇作為潤(rùn)濕劑，通過(guò)噴淋的方法加入，邊加邊攪拌，直至能形成軟材，使其“手握成團(tuán)，輕壓即散”，使用 10 目篩手動(dòng)制粒，在60 ℃下干燥，用 10 目篩整粒，用于指標(biāo)的測(cè)定。

采用成型率、堆密度、休止角、溶化性以及吸濕指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)顆粒的質(zhì)量，綜合指標(biāo) =(20/最大成型性值)×成型性值 + (15/最大堆密度值)×堆密度值 +(最小休止角值 ×15)/45止角值 +(20/最大溶化性值)×溶化性值 +(最小吸濕率值 ×30)/吸濕率值，通過(guò)采用加權(quán)評(píng)分法分析試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化輔料的篩選和顆粒的成型工藝。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化 根據(jù)2020版《中國(guó)獸藥典》及現(xiàn)有文獻(xiàn)資料關(guān)于制粒的要求，選擇藥物與輔料配比(A)，乙醇濃度(B)，烘干溫度(C)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化顆粒劑的制備[7]，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表見(jiàn)表3。按1.2.4制粒，測(cè)定顆粒的成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性指標(biāo)[8-10]。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab 3 Factor level table of orthogonal experiment design

1.2.5.1 成型率測(cè)定 將制備好的顆粒稱(chēng)重，先過(guò)一號(hào)篩，再過(guò)四號(hào)篩，收集能通過(guò)一號(hào)篩但不能通過(guò)四號(hào)篩的顆粒，稱(chēng)重。成型率=過(guò)篩后顆粒質(zhì)量/過(guò)篩前顆粒質(zhì)量×100%。成型性分值計(jì)算運(yùn)用公式：(20/最大成型性值)×成型性值。

1.2.5.2 堆密度的測(cè)定 將過(guò)篩后的顆粒放入干燥的量筒中，輕輕振動(dòng)，讀出其近刻度處的mL數(shù)(V)；將過(guò)篩后的質(zhì)量作為M(g)，兩者的比值即為堆密度。堆密度=M/V堆密度分值計(jì)算運(yùn)用公式：(15/最大堆密度值)×堆密度值。

1.2.5.3 休止角測(cè)定 采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯(lián)并固定于鐵架臺(tái)上水平放置的同心圓坐標(biāo)紙上1 cm的高度處，小心地將顆粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗中，直到坐標(biāo)紙上形成的顆粒圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，由坐標(biāo)紙測(cè)出圓錐底部的直徑(2R)，計(jì)算出休止角tan=H/R，做5次，計(jì)算平均值。休止角分值計(jì)算運(yùn)用公式：(最小休止角值×15)/休止角值。

1.2.5.4 溶化性測(cè)定 在干燥恒重的50 mL離心管中加入精密稱(chēng)定的顆粒，精密加入沸水至50 mL刻度線，攪拌振搖5 min，3000 r/分鐘離心15 min，棄去上清液，在70 ℃將殘?jiān)娓芍梁阒?，精密稱(chēng)定，計(jì)算溶化率。溶化率=溶化顆粒質(zhì)量/顆粒質(zhì)量×100%。溶化率分值計(jì)算運(yùn)用公式：(20/最大溶化性值)×溶化性值。

1.2.5.5 吸濕性測(cè)定 取一定量的顆粒劑，置30 ℃烘箱中恒重48 h。將底部放有NaCl飽和溶液的玻璃干燥器中定時(shí)放入NaCl直到形成NaCl過(guò)飽和溶液，此時(shí)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為 75%。在已知恒重的小燒杯中放入約10 g參黃顆粒，準(zhǔn)確稱(chēng)重后置于上述干燥器內(nèi)。48 h后稱(chēng)量，計(jì)算吸濕百分率。共做兩組，計(jì)算平均值。吸濕百分率%=(吸濕后重量-吸濕前重量)/吸濕前重量×100%。吸濕率分值計(jì)算運(yùn)用公式：(最小吸濕率值 ×30)/吸濕率值。

1.2.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)制備顆粒劑正交試驗(yàn)的結(jié)果，重復(fù)制備三批顆粒制劑。按處方配比準(zhǔn)確稱(chēng)取原料，按正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝進(jìn)行制粒，測(cè)定各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算綜合評(píng)分。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)與分析 采用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3軟件對(duì)計(jì)算處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行正交統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-圖3。結(jié)果，樣品中橙皮苷與相鄰雜峰分離良好，陰性樣品在橙皮苷處無(wú)吸收，不干擾參黃顆粒中橙皮苷的含量測(cè)定，表明在利用HPLC-UV方法測(cè)定參黃顆粒中橙皮苷含量中，該方法的系統(tǒng)適應(yīng)性好。理論塔板數(shù)按橙皮苷計(jì)為8132。

圖1 橙皮苷對(duì)照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of Hesperidin standard

圖2 參黃顆粒劑供試品中中橙皮苷色譜圖Fig 2 Chromatogram of Hesperidin in Shenhuang granules

圖3 陰性樣品中橙皮苷色譜圖Fig 3 Chromatogram of Hesperidin in negative sample

2.2 中藥提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 中藥提取工藝正交交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表4.1、4.2，影響參黃顆粒回流提取效果的因素大小依次為A>C>B，最佳組合為A2B2C3，即最佳水提工藝為加9倍水，回流提取3次，每次提取時(shí)間1 h?？傇u(píng)分=A1+A2；A1=(橙皮苷/最大橙皮苷含量)×50、A2=(出膏率/最大出膏率)×50；提取工藝驗(yàn)證：為考察參黃顆粒優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，需按照最佳優(yōu)選方案對(duì)3批次參黃顆粒水提液進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明橙皮苷含量分別為1.005、0.995、1.007 mg/g，出膏率分別為26.08%、25.31%、26.46%，符合預(yù)期設(shè)計(jì)。

表4-1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 4-1 Orthogonal experiment results

表4-2 方差分析表Tab 4-2 AnOVA table

2.3 成型率測(cè)定 成型率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 成型性測(cè)定結(jié)果Tab 5 Test results of formability

2.4 堆密度測(cè)定 堆密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 堆密度測(cè)定結(jié)果Tab 6 Measurement results of heap density

2.5 休止角測(cè)定 休止角測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 休止角測(cè)定結(jié)果Tab 7 Measurement results of Angle of repose

2.6 溶化性測(cè)定 溶化性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 溶化性測(cè)定結(jié)果Tab 8 Solubility test results

2.7 吸濕性測(cè)定 吸濕性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 吸濕性測(cè)定結(jié)果Tab 9 Results of hygroscopicity measurement

2.8 綜合評(píng)價(jià) 通過(guò)對(duì)制備顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性按一定百分比綜合評(píng)價(jià)來(lái)得出顆粒劑的最終評(píng)價(jià)得分，綜合評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 10 Comprehensive evaluation results

2.9 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，確定各因素與水平的最佳組合應(yīng)為A2B1C2，即最佳制粒工藝為：選用浸膏粉∶可溶性淀粉∶糊精∶蔗糖比例為3∶2∶2∶1，用80%乙醇制成軟材，過(guò)16目篩制粒，于60 ℃烘干。結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 11 Orthogonal experiment results

2.10 成型工藝驗(yàn)證 取1.2.1項(xiàng)下制得的干浸膏粉，按照選出的成型工藝平行操作制備三批顆粒劑，按照上述制備3批顆粒劑，按上述方法綜合評(píng)分，計(jì)算綜合評(píng)分97.18，96.99，97.21，RSD值為0.13%，驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說(shuō)明提取工藝穩(wěn)定，可行，重復(fù)性好。將上述按最佳方案所制得的顆粒分別取 10 g，加熱水 200 mL，攪拌 5 min，其顆粒基本全部溶化，均符合2020 版《中國(guó)獸藥典》二部(附錄8)顆粒劑項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

長(zhǎng)期以來(lái)，由于湯劑易吸收、起效快、療效好、制備方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，一直是中獸醫(yī)臨床的主要用藥形式，歷代中獸醫(yī)在使用中獸藥時(shí)，也大多采用湯劑，然而在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用過(guò)程中湯劑卻存在很多缺點(diǎn)，比如口味不佳、不易攜帶、不易儲(chǔ)存、保質(zhì)期短等，因此本實(shí)驗(yàn)本著中獸藥制劑向著療效好、質(zhì)量穩(wěn)定可控，便于貯存、攜帶、運(yùn)輸，使用方便的發(fā)展原則，且適用于工業(yè)生產(chǎn)，故將顆粒劑作為首選劑型[11-12]。

中獸藥復(fù)方的作用與多種成分相關(guān)，用一種評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選參黃顆粒的提取工藝和制備工藝的條件往往不夠全面。出膏率是中成藥制藥行業(yè)提取中一個(gè)特有名詞以及重要的質(zhì)量管理指標(biāo)。同時(shí)，浸膏是中獸藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是中獸藥制劑制備的中間品，是提取工藝最直觀的產(chǎn)物，對(duì)評(píng)價(jià)一種提取工藝的優(yōu)劣有著重要意義。有效成分是中獸藥復(fù)方發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是復(fù)方中的有效成分多且復(fù)雜，若是選取所有的有效成分作為指標(biāo)考核制備工藝顯然無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因此實(shí)驗(yàn)中多采用選取復(fù)方中主藥的有效成分作為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)制備工藝的優(yōu)劣[13-14]。在預(yù)試驗(yàn)階段，選擇對(duì)黨參中黨參炔苷進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示黨參炔苷含量較低，不宜作為參黃顆粒工藝優(yōu)化的定量測(cè)定；同時(shí)，在預(yù)試驗(yàn)階段也選擇了熟地黃中毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示毛蕊花糖苷含量也較低，且分離度較差，故也不宜作為參黃顆粒工藝優(yōu)化的定量測(cè)定；而采用以陳皮中橙皮苷為含量測(cè)定指標(biāo)時(shí)，結(jié)果表明橙皮苷的峰型較高，分離度和對(duì)稱(chēng)性好，陰性無(wú)干擾。最終，確定本試驗(yàn)通過(guò)多因素正交試驗(yàn)的方法，以橙皮苷含量和浸膏得率為指標(biāo)，考察提取工藝；以顆粒劑成型性、堆密度、休止角、溶化性以及吸濕性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，考察制備工藝。通過(guò)綜合評(píng)價(jià)處理數(shù)據(jù)，以及直觀分析和方差分析，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到的結(jié)果更為科學(xué)合理。

在對(duì)藥材水提后的浸膏進(jìn)行干燥時(shí)，因?yàn)椴捎闷胀ê娓上浜娓伤钑r(shí)間會(huì)較長(zhǎng)，同時(shí)制得的干膏干燥程度不夠，質(zhì)地粘軟，不宜粉碎，此外，整個(gè)干燥過(guò)程在低溫和非常稀薄的空氣中進(jìn)行，可避免常見(jiàn)的干燥加工過(guò)程中物料熱敏性成分的破壞和易氧化成分等劣變反應(yīng)，處理后的產(chǎn)品活性物質(zhì)(特別是藥用有效成分)保存率高，芳香物質(zhì)揮發(fā)性降低，產(chǎn)品性味濃厚，所以在濃縮到稠浸膏后選用冷凍真空干燥進(jìn)行干燥處理。同時(shí)考慮到藥材水提物粘度大，干膏打粉后極易吸潮結(jié)塊，在制粒過(guò)程中產(chǎn)生死顆粒，所以將傳統(tǒng)制粒步驟加以改進(jìn)，在真空冷凍干燥步驟前向浸膏中加入一定量的可溶性淀粉攪拌均勻，來(lái)防止發(fā)生這種問(wèn)題，結(jié)果表明效果良好。

中藥提取物工藝采用正交試驗(yàn)法，以橙皮苷及浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳提取工藝為：稱(chēng)取黨參，熟地，麥冬，木香，茯苓，白術(shù)，陳皮，甘草，加 9倍量回流3次，每次1 h，合并三次提取液，過(guò)濾既得。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果基本一致，該提取方法穩(wěn)定、可行。

以顆粒劑成型性、堆密度、休止角、溶化性以及吸濕性為綜合評(píng)價(jià)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，篩選出最佳制粒工藝為：選用可溶性淀粉、糊精、蔗糖為輔料，浸膏粉：可溶性淀粉：糊精：蔗糖比例為3∶2∶1∶1，用80%乙醇制成軟材，過(guò) 16 目篩制粒，于 60 ℃烘干。驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說(shuō)明提取工藝穩(wěn)定，可行，重復(fù)性好。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了參黃顆粒劑的制備工藝：加 9 倍量的水回流提取3次，每次 1 h，合并3次提取液，過(guò)濾。取濾液濃縮至相對(duì)密度為 2 g/mL的清膏，鋪平冷凍干燥圓盤(pán)(3 mm厚度，多次少量)，減壓冷凍干燥(-50 ℃以下，0.0001Mpa)至恒重，粉碎成細(xì)粉得干膏粉。以浸膏粉：可溶性淀粉：糊精：蔗糖= 3∶2∶1∶1 的比例，混合均勻，加 80%乙醇制成軟材，過(guò)10目篩制粒，60 ℃烘干，整粒后，既得。