多粘類芽孢桿菌的研究進展

劉守德，劉華梅，周 莉，黃 芳，徐 廣，武若楠，王小華，3，胡國元*

1.武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北 武漢 430205；

2.武漢科諾生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430074；

3.武昌理工學院生命科學學院，湖北 武漢 430223

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa，P.polymyxa）是一類芽孢桿菌科類芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性細菌，1993年由Ash等［1］將其歸為類芽孢桿菌屬之前又名多粘芽孢桿菌。作為類芽孢桿菌屬的模式菌株P(guān).polymyxa也是一類重要的植物根際促 生 菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）。由于既可以作為微生物肥料促進作物的生長和增產(chǎn)增收，又可以用作生物農(nóng)藥防治多種植物病害發(fā)生且使用安全無環(huán)境污染，P.polymyxa被美國環(huán)保署定為可作商用的微生物之一［2］。P.polymyxa通過固氮、溶磷、獲取鐵以及產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)劑等方式來促進植物的生長發(fā)育，通過產(chǎn)生殺蟲或殺菌活性物質(zhì)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性等方式實現(xiàn)生物防治［3］，還可以用作底盤菌株來發(fā)酵生產(chǎn)如多粘菌素、β-葡聚糖、果膠酶等多種活性物質(zhì)用于生物醫(yī)藥和工業(yè)制造等領(lǐng)域。目前除了多粘菌素應(yīng)用較為成熟外，國內(nèi)生產(chǎn)的與P.polymyxa相關(guān)農(nóng)用及工業(yè)化產(chǎn)品多用于出口，對其生物防治、土壤修復(fù)、選礦、水處理的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用大多仍處于實驗階段。本文綜述了P.polymyxa的功能基因組研究、代謝活性物質(zhì)研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用現(xiàn)狀，為P.polymyxa的研發(fā)與應(yīng)用提供思路。

1 功能基因組研究

P.polymyxa的基因研究起步相對較晚。在全基因組測序方面典型的P.polymyxa菌株SQR21、CR1、SC2［4］、ATCC842［5］、E681［6］、M1、Sb3-1 等全長序列或部分基因草圖均已錄入GenBank。在基因克隆、鑒定、表達分析方面P.polymyxa已完成了多個基因的功能注釋如：抗生素合成基因如E681中關(guān)于合成多粘菌素的基因簇pmxA-E［7］，菌株SQR-21 中合成鐮刀菌素的基因簇fus［8］等；植物促激素相關(guān)基因如E681 中吲哚乙酸合成途徑的吲哚-3-丙酮酸脫羧酶基因［9］，多種多糖相關(guān)產(chǎn)物合成基因如CP 7 中β-葡聚糖酶基因［10］等；肽類和聚酮類合成相關(guān)的基因等。Park 等對P.polymyxaE681 合成的羊毛硫類抗生素的基因簇進行了分析和表征，證實該新型抗生素產(chǎn)物可用于抑制部分革 蘭 氏 陽 性 菌 的 生 長［11］。 He 等 探 究 了P.polymyxaWLY78 菌株中的pep-2基因簇與生物膜的 形 成 之 間 的 聯(lián) 系［12］。 Soni 等 分 析 了P.polymyxaHK4 中部分與編碼非核糖體合成肽相關(guān)的合成基因簇［13］。Wang 對P.polymyxa的泛基因組和核心基因組的進行分析后發(fā)現(xiàn)泛基因組是開放的，核心基因共有3 192 個。797 個次生代謝物的基因簇中有343 個與公開報道的基因簇不相似，這有望揭示大量新的次生代謝物的合成機理，此外還分析了部分高度保守的植物生長促進基因，并表明植物促生作用是P.polymyxa對相關(guān)生存環(huán)境的進化適應(yīng)［14］。

2 代謝活性物質(zhì)研究

除了上述功能基因編碼合成的各種抗生素和植物促激素外，P.polymyxa還能產(chǎn)生諸如胞外多糖、拮抗蛋白、酶、核苷類等大量代謝活性物質(zhì)。這些代謝活性物質(zhì)具有絮凝、助懸浮、吸附重金屬、抑菌、抗氧化、預(yù)防和治療疾病等功能，具有廣闊的應(yīng)用前景（見表1）。

表1 多粘類芽孢桿菌的代謝活性物質(zhì)Tab.1 Metabolic active substances of P.polymyxa

2.1 胞外多糖

微生物多糖是一些由真菌、細菌和藻類等代謝形成的多糖。根據(jù)其所處部位又可分為胞內(nèi)多糖、胞壁多糖和胞外多糖。胞外多糖通常是以粘液的形式分泌到環(huán)境中或以莢膜的形式附著在細胞壁外，防止脫水和原生動物的吞食對生物體起保護作用。胞外多糖是P.polymyxa的一種重要產(chǎn)物，具有乳化、助懸浮、富集重金屬、抗氧化和抑制腫瘤細胞生長等多方面功能。通常P.polymyxa產(chǎn)生的胞外多糖是由葡萄糖、半乳糖、葡聚糖、果聚糖、甘露糖、海藻糖和葡萄糖醛酸中的一種或幾種組成。利用大孔樹脂對P.polymyxaEJS-3 產(chǎn)生的胞外多糖分離和鑒定為果聚糖［15］。除果聚糖外P.polymyxa還可代謝產(chǎn)生β-葡聚糖［16］。研究表明從P.polymyxaNCIB 11429 的發(fā)酵液中純化得到的雜多糖（Biopolymer PS 87）對細沙具有較好的助懸浮作用。胞外多糖有助于細胞團塊的形成和微粒子的絮凝［17］，因此可利用此特性進行污水處理。?olak 等研究了P.polymyxa對重金屬的抗性和吸附性能，研究表明可吸附銅49.8 mg/g，鎳35.02 mg/g［18］。此外P.polymyxaJB115 可通過MAPK 和NFJB 信號通路誘導(dǎo)產(chǎn)生NO 來激活巨噬細胞［19］以清除腫瘤，這為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了思路。

2.2 抗菌物質(zhì)

P.polymyxa產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)按分子量大小依次可分為大分子量的拮抗蛋白或酶、小分子量的肽類抗生素和核苷類物質(zhì)等?？咕钚缘牡鞍最愇镔|(zhì)主要由核糖體代謝途徑產(chǎn)生，可特異性的降解宿主菌的核細胞壁。這些大分子的拮抗蛋白（酶）包括β-1，3-葡聚糖酶［20］、幾丁質(zhì)酶［21］、蛋白酶［22］和果膠裂解酶［23］等。此外P.polymyxa還可以產(chǎn)生多種不具酶活性的蛋白，但這些蛋白對特定的植物病原菌依然擁有較好的拮抗效果。如Kavith 等［24］從P.polymyxaVLB16 的發(fā)酵液中純化到的分子量大小為37 kDa 的拮抗蛋白，對水稻紋枯病菌和稻痕病菌孢子有較好的抑制效果［25］。P.polymyxaCp-S316 可產(chǎn)生分子量介于6～14.2 kDa 的拮抗蛋白對辣椒炭疽病菌有很好的抑制效果。

P.polymyxa產(chǎn)生的小分子結(jié)構(gòu)的肽類抗生素主要是經(jīng)過非核糖體代謝途徑由非核糖體肽類合成酶（NRPS）產(chǎn)生。根據(jù)其拮抗對象的不同可分為兩種，第一種是對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌有抑制效果［26］并且其結(jié)構(gòu)含有特征性的非蛋白氨基酸-二氨基丁酸的抗生素，包括多粘菌素、喬利肽菌素、谷丙纈絲素、絲丙亮蘇纈素和polypeptins 等。第二種可對放線菌、真菌和部分革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生拮抗作用的抗生素，包括殺鐮孢菌素、十三肽素、LI-F 抗菌素和谷天蘇丙纈素等。這些肽類抗生素中具有生物防治作用的主要是十三肽素、殺鐮孢菌素和多粘菌素。多粘菌素和殺鐮孢菌素的結(jié)構(gòu)特征、抗菌活性、作用機制及應(yīng)用均有報道，而谷丙纈絲素、谷天蘇丙纈素、絲丙亮蘇纈素、喬利肽菌素和尼柯霉素迄今未見其詳細的結(jié)構(gòu)報道，這些新型抗生素的結(jié)構(gòu)分析有賴于如質(zhì)譜和核磁等檢測分析技術(shù)的進一步發(fā)展。

P.polymyxa產(chǎn)生的核苷類抗菌物質(zhì)主要有多氧霉素［27］等。polyoxin 的分子結(jié)構(gòu)與UNP-N-乙酰葡萄糖類似，對幾丁質(zhì)合酶有競爭性抑制作用，通過控制真菌細胞壁成分幾丁質(zhì)的合成來達到抑制植物病原真菌生長的效果［28］。polyoxin 可以抑制如水稻紋枯病病原菌和梨樹黑斑病等的病原菌生長。

2.3 植物激素

P.polymyxa可產(chǎn) 生如吲哚-3-乙酸［29］、生 長素［30］、乙烯［31］、雙萜化合物類的赤霉素［32］和腺嘌呤衍生物類的細胞分裂素［33］等多種植物生長激素來促進作物生長發(fā)育。用P.polymyxaHK4 處理花生種子比對照實驗組獲得更高的發(fā)芽率［34］。用P.polymyxa92 處理小麥后可明顯增加植物的有絲分裂，小麥的根長增加22%，根干重增加28%［35］。

2.4 其他活性物質(zhì)

在分析P.polymyxa的代謝活性物質(zhì)時還找到了其他應(yīng)用價值較高的活性物質(zhì)，如在P.polymyxa代謝產(chǎn)物的化學成分分析中發(fā)現(xiàn)了一種異黃酮類物質(zhì)（金雀異黃素）。金雀異黃素具有抑制炎癥、促進細胞凋亡以及調(diào)節(jié)甾體激素受體和代謝途徑等作用［36］，在預(yù)防和治療疾病方面具有廣闊的前景。除金雀異黃素外Schilling 等通過CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對P.polymyxa改良來生產(chǎn)R-，R-2，3-丁二醇，其發(fā)酵產(chǎn)量達到43.8 g/L［37］。R-，R-2，3-丁二醇是一種潛在的大宗平臺化合物，被廣泛的使用在醫(yī)藥、食品和燃料等領(lǐng)域。此外，P.polymyxa還能代謝產(chǎn)生羥基苯甲醛［38］、果膠裂解酶、吩嗪-1-羧酸（PCA）［39］等。由P.polymyxaSCE2 合成的吩嗪-1-羧酸對植物病原菌具有很好的抑制作用，同時兼具醫(yī)用殺菌及抗腫瘤等功效。P.polymyxa代謝產(chǎn)生的β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶可有效的降解非淀粉類多糖，從而擴大的微生物制造過程中的原料利用范圍，其代謝通路中涉及的“元件”和“線路”也為合成生物學實現(xiàn)酶系的異源表達構(gòu)建工程菌提供了思路。

3 應(yīng)用研究

隨著對P.polymyxa功能性基因組的挖掘和代謝活性物質(zhì)的研究，學者們開發(fā)出了P.polymyxa在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的不同應(yīng)用，諸如用作生物肥料、生物農(nóng)藥、酶的生產(chǎn)、抗感染和疾病預(yù)防等方面（表2）。

表2 多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用Tab.2 Application of P.polymyxa

3.1 農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究

PGPR 的概念最初由Kloepper 和Schroth 所提出，是指生活在根際或根際土壤的可直接或間接促進作物生長，并提高植物抗逆性的一類微生物。其促生作用分為直接和間接作用兩種，直接促生作用通常是指利用PGPR 產(chǎn)生的生物固氮、溶解磷和鉀、產(chǎn)鐵載體和植物激素等作用來促進植物生長。間接促生作用則是通過誘導(dǎo)植物抗性（induced systemic resistance，ISR），與病原菌競爭生存空間和營養(yǎng)資源等方式實現(xiàn)。作為一株重要PGPR 資源，P.polymyxa的功能包括固氮［40］、溶解磷［3］、獲取鐵［3］、分泌植物促激素［30］和拮抗植物病原菌［41］。由于存在固氮基因簇nif［42］P.polymyxaCR1 可在無氮培養(yǎng)基上生長并表現(xiàn)出其強大的固氮能力［43］。將松樹幼苗接種至P.polymyxaP2b-2R后在氮標記的土壤混合物中生長，幼苗的氮含量及幼苗重量提升一倍［44］。P.polymyxaSX-3 通過分泌有機酸來促進土壤中磷酸鈣的溶解進而提高植物對磷的吸收量，SX-3 菌株的平板實驗對磷酸鈣的水解圈高達7 mm［41］。P.polymyxaSQR-21 能 表達多個5～140 kDa 的載體蛋白，其中部分蛋白可以參與鐵的轉(zhuǎn)運［45］。郭芳芳等對P.polymyxaCF05展開了相關(guān)的植物實驗，研究結(jié)果表明CF05 菌株發(fā)酵液及菌懸液對番茄幼苗有明顯的促生長效果，經(jīng)CF05 發(fā)酵液處理后的番茄幼苗的鮮重增加272.0%，干重增加266.7%［46］。除促進植物生長外，P.polymyxa還能分泌多種拮抗蛋白來實現(xiàn)生物防治作用。研究表明可利用P.polymyxaGBR-1抑制根結(jié)線蟲，不同質(zhì)量分數(shù)（25%～100%）的P.polymyxaGBR-1 的發(fā)酵濾液中對線蟲的蟲卵孵化率抑制率為84%～91%［47］。山東省科學院生物研究所從黃瓜霜霉病的蔬菜大棚中篩選到的P.polymyxaPB-2 的發(fā)酵液對葡萄霜霉病的抑制率達到了77.21%，制備的可濕性粉劑在田間應(yīng)用稀釋50 倍和100 倍的防效明顯［28］。湖北省生物農(nóng)藥工程中心閔勇等對P.polymyxaNBF188 進行常溫常壓等離子體誘變篩選得到高產(chǎn)菌株NBF188-R，菌株NBF188-R 對青枯勞爾氏菌的抑制效果顯著加強［48］。

3.2 工業(yè)應(yīng)用研究

酶是活細胞產(chǎn)生的一種高效的生物催化劑，工業(yè)上通常經(jīng)微生物發(fā)酵獲得。P.polymyxa是多種酶制劑生產(chǎn)的底盤菌株。趙巖等篩選出的P.polymyxaKF-1 可用于高效生產(chǎn)果膠 裂解酶［49］。蔣紅菊等對P.polymyxa20185 發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的生產(chǎn)工藝做了初步探索，為其在造紙、洗滌等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［50］?？讘c祥等研究了P.polymyxaT 1163 的紅麻干皮脫膠工藝，與天然脫膠工藝相比工時明顯縮短［51］。李衛(wèi)芬等研究了P.polymyxa產(chǎn)生β-葡聚糖的工藝，為β-葡聚糖在飼料行業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)［52］。Rafigh 等利用P.polymyxaATCC 21830 首次生產(chǎn)卡德蘭膠，獲得的卡蘭德膠平均分子量為170 kDa，其紅外光譜、核磁光譜和X 射線衍射圖與市面上的卡德蘭膠的樣品幾乎相同［53］。在礦工業(yè)上，P.polymyxa可附著在礦物表面形成生物膜，進而分泌活性代謝物質(zhì)以改變礦物的表面組成，結(jié)合產(chǎn)生的如有機酸、多糖等成分催化氧化還原反應(yīng)來吸附和聚集重要的礦物成分。Patra 等通過電動學分析和絮凝吸附實驗對P.polymyxa選擇性分離黃鐵礦和方鉛礦的機理進行了深入探究［54］。除了生產(chǎn)酶制劑及多糖、苧麻脫膠、生物選礦外，P.polymyxa還可用于污水處理等領(lǐng)域。

3.3 醫(yī)藥應(yīng)用研究

多粘菌素是由P.polymyxa產(chǎn)生的一種多肽類抗菌藥物，主要用于治療革蘭氏陰性細菌如綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌等引起的感染。多粘菌素有多種異構(gòu)體，目前在臨床應(yīng)用的主要是多粘菌素B 和多粘菌素E。此外，P.polymyxaJB115 產(chǎn)生的β-葡聚糖可通過誘導(dǎo)巨噬細胞激活來清除體內(nèi)的腫瘤細胞，為抗癌藥物的開發(fā)提供了思路。Liu 等發(fā)現(xiàn)由P.polymyxaEJS-3 產(chǎn)生的胞外多糖及其衍生物具有較強的還原能力及超氧自由基、羥基自由基的清除能力，并可用于抑制人胃癌細胞的增殖［55］。姬慶等通過P.polymyxa發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參產(chǎn)物比人參具有更好的抗腫瘤效果，通過阻斷細胞之間的生物信息交流實現(xiàn)對人乳腺癌MCF-7 和皮膚癌A375 較好的抑制［56］，這種發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參以提升人參的疾病治療效果的方案也可供其他天然植物的微生物轉(zhuǎn)化參考。

4 結(jié) 論

關(guān)于P.polymyxa活性代謝物研究當前主要集中在多糖、多肽和部分植物促激素上，除多粘菌素、殺鐮刀菌素和吲哚-3-乙酸外，其他活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及其合成途徑尚不清晰。該菌與植物及與土壤中其他微生物的之間的互作機理亦未進行深入研究，P.polymyxa的分子生物學改造還有較大的空間。此外，P.polymyxa在田間應(yīng)用所面臨的的實際問題如環(huán)境的變化等對其使用效果的影響還需進一步探索。未來關(guān)于P.polymyxa的研究工作將圍繞利用基因編輯技術(shù)等分子生物學手段實現(xiàn)高產(chǎn)菌株的改造，新型代謝活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定和功能開發(fā)，利用宏基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等手段分析多粘芽孢桿菌與植物和土壤微生物之間的互作機理來展開，進而開發(fā)出新的功能性產(chǎn)品和提高已有產(chǎn)品的應(yīng)用效果。