頂空氣相色譜法測定磷霉素氨基葡萄糖鹽殘留的研究

蘇小雅，馬 強，張尹萌，田麗敏，楊 柳，祝 宏*

1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205；

2.武漢市藥物增溶工程技術研究中心，湖北 武漢 430205；

3.武漢軟件工程職業(yè)學院，湖北 武漢 430205

磷霉素是天然廣譜的小分子抗生素，對革蘭陰性菌和格蘭陽性菌具有較高的抗菌活性，磷霉素與其他多種抗生素聯(lián)合使用時均有協(xié)同作用［1-3］。磷霉素獨特的抗菌作用機制使得它再度成為近來被廣泛關注并研究的老藥之一［4-6］。磷霉素類抗生素通過干擾細胞壁的合成，從而發(fā)揮了廣譜的抗菌作用［7-8］。殼寡糖是天然天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖［9］。磷霉素中作為藥效團的環(huán)氧鍵不穩(wěn)定，常以鹽的形式存在從而獲得較高的穩(wěn)定性［10］。由于殼寡糖的聚合度和分子量不方便準確測定，故選用D-氨基葡萄糖進行合成反應制備。利用拼合原理將兩種藥物拼合在一起，得到的新結構可以改變原有藥物的藥代動力學，有利于增加藥物的穩(wěn)定性［11-13］。

實驗室自制的磷霉素氨基葡萄糖鹽，用二氯甲烷萃取磷霉素鈉水溶液中的α-苯乙胺，活化后的苯乙烯樹脂處理磷霉素鈉水溶液，用乙醇洗脫后得到磷霉素酸，與經(jīng)由強堿性陰離子交換樹脂的游離氨基葡萄糖溶液混合，減壓蒸餾除去部分乙醇和水，液氮預冷后經(jīng)冷凍干燥得到磷霉素氨基葡萄糖鹽。其中，萃取過程以及洗脫過程極易引起溶劑殘留，故需對二氯甲烷及乙醇進行殘留溶劑的檢查。

殘留溶劑的毒性及致癌作用開始引起醫(yī)藥界的關注［14-15］。磷霉素氨基葡萄糖鹽原料藥在制備過程中使用了乙醇和二氯甲烷，且重結晶也是使用乙醇純化。根據(jù)2020 版《中國藥典》中的規(guī)定要求，乙醇屬第三類溶劑，二氯甲烷屬第二類溶劑，故在原輔料的制備中需要對相關有機溶劑的殘留指標進行控制。氣相色譜法測定殘留溶劑是眾多藥品測定殘留溶劑的首選方法［16-18］。因此本實驗建立了以氣相色譜法來測定磷霉素氨基葡萄糖鹽原料藥的溶劑殘留的方法，為該原料藥的質量標準以及進一步的研究提供理論參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

無水乙醇（國藥集團化學試劑公司），二氯甲烷（國藥集團化學試劑公司）均為色譜純（純度＞99.8%），新鹽樣品為實驗室自制（批號分別為2107001，2107002，2107003，2107004，2107005）。

安捷倫7890 氣相色譜儀，配備火焰氫離子化檢測器，7697A 頂空進樣器和7693A 自動進樣器；氮、氫、空一體機（北京中惠普分析技術研究所NHA-300），載氣為高純氮；Agilent GC ChemStation 色譜工作站；METTLER TOLEDO 電子分析天平；Ultra pro 超純水機（北京廣開源商貿有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，美國Agilent 公司）；柱溫：起始溫度為40 ℃，維持10 min，以20 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，維持5 min；進樣口溫度210 ℃；檢測器溫度250 ℃；分流比40∶1；載氣流速2.5 mL/min。頂空瓶平衡溫度為85 ℃，平衡時間為30 min。

1.2.2 溶液配制 對照品溶液配制：精密稱取無水乙醇1 000 mg，二氯甲烷600 mg，置于同一個100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻密封待用。供試品溶液配制：精密稱定新鹽樣品0.25 g，溶于水中并定容至50 mL 容量瓶，搖勻密封待用。

2 結果與討論

2.1 方法專屬性試驗

分別準確量取“1.2.2”項下空白溶劑，混合對照品溶劑5 mL 于20 mL 頂空瓶中，與供試品溶液按“1.2.1”的色譜條件進行測定。結果見圖1，無水乙醇、二氯甲烷的保留時間分別為1.414 min 和1.560 min，2 種溶劑分離度符合要求，空白溶劑不干擾測定。

圖1 專屬性試驗氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of specificity test

2.2 線性范圍

取混合對照儲備液20 mL 于100 mL 容量瓶中，加純化水稀釋并定容，搖勻待用；分別移取5，4，3，2，1 mL 分別置于5 個10 mL 容量瓶中，加水定容稀釋，搖勻待用，將稀釋后的容量瓶中溶液分別移取5 mL 于20 mL 頂空瓶中，密封待測。將待測成分濃度作為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到線性回歸方程以及線性范圍。結果見表1。

表1 乙醇，二氯甲烷的線性回歸方程和線性范圍Tab.1 Linear regression equation and linear range for ethanol and methylene chloride

2.3 定量限與檢出限

取一定量的“1.2.2”項下配制的混合對照品溶液，然后進行稀釋，稀釋后的溶液按照“1.2.1”項下的色譜條件進行進樣檢測，以信噪比S/N=3 計算各殘留溶劑的最低檢出限，以信噪比S/N=10 計算各殘留溶劑的最低定量限，檢測出的乙醇定量限為1.5 μg/mL，檢出限為0.5 μg/mL，二氯甲烷的定量限為0.6 μg/mL，檢出限為0.15 μg/mL。

2.4 精密度

平行取一定量的“1.2.2”項下配制的混合對照品溶液六份，按照“1.2.1”項下的色譜條件進行檢測，記錄結果。結果可得，乙醇和二氯甲烷峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為4.0%，2.8%（n=6），說明該研究方法重復性良好。

2.5 加標回收率

由2020 版《中國藥典》可知，乙醇和二氯甲烷殘留溶劑的殘留限度分別為0.5%和0.06%。分別在樣品（批號：2107002）中按乙醇和二氯甲烷的殘留溶劑限值的80%，100%，120%進行回收率試驗并計算。計算結果見表2。

表2 回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests n=3

2.6 樣品的含量測定

取5 批磷霉素氨基葡萄糖新鹽（批號為2107001，2107002，2107003，2107004，2107005）樣品，按“1.2.2”項下方法配制溶液，分別取5 mL 置于5 個頂空瓶中，密封待測，按“1.2.1”項下方法進行檢測。

結果表明，5 批樣品中的乙醇含量不超過規(guī)定限度，未檢測出二氯甲烷的含量（見表3）。

表3 樣品中有機溶劑殘留量的測定結果Tab.3 Determination of residual organic solvents in samples n=3

2.7 討 論

本實驗對樣品溶劑的選擇進行了考察，通過比較了N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，甲醇和水4 種溶劑，發(fā)現(xiàn)樣品在以上溶劑中只溶于甲醇和水。由于樣品在水中的溶解性較好，且水的沸點都要高于乙醇和二氯甲烷的沸點，故選擇水為溶劑進行樣品的溶解。實驗中分別試驗了10∶1，20∶1，40∶1 三個分流比，通過實驗過程中發(fā)現(xiàn)當分流比為40∶1 時，出的樣品峰形較好，無明顯拖尾現(xiàn)象。

3 結 論

本文建立了測定磷霉素氨基葡萄糖鹽原料藥中有機溶劑乙醇和二氯甲烷殘留量的頂空氣相色譜的方法，并對制備樣品中的乙醇和二氯甲烷的殘留量進行了檢查。實驗通過使用頂空氣相色譜儀，對殘留溶劑的系統(tǒng)適用性試驗，線性范圍，定量限，檢測限，精密度和加標回收率進行考察，實驗結果表明：本檢測方法可適用于磷霉素氨基葡萄糖鹽原料藥中的有機殘留溶劑的檢查。原料藥在合成步驟所運用到的乙醇和二氯甲烷有機溶劑的檢測結果均滿足2020 版《中國藥典》所述的對化學有機殘留溶劑的相關規(guī)定。以此方法來作為本課題組檢測所合成的原料藥殘留溶劑的方法學和質量控制的標準，為下一步的研究以及后續(xù)藥品的生產(chǎn)上市提供有效技術支持。