miR-139-5p靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制

林木平，黃振華

（深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518102）

肝癌作為臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率及轉(zhuǎn)移率。此病患者的預(yù)后較差。早期肝癌患者多通過(guò)外科手術(shù)將腫瘤切除。但多數(shù)肝癌患者的臨床表現(xiàn)不典型，其病情極易被忽視，在得到確診時(shí)多已發(fā)展至中晚期，錯(cuò)失了最佳的治療時(shí)機(jī)[1]。晚期肝癌患者腫瘤的手術(shù)切除率僅有20% 左右，且其預(yù)后欠佳，生存率較低。近年來(lái)隨著我國(guó)醫(yī)療水平的提高，放化療、靶向治療、免疫治療及納米治療等被相繼提出，在晚期肝癌的治療中取得了較好的效果[2]。人體的正常細(xì)胞通過(guò)惡變可轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。P53 是人體內(nèi)重要的抑癌基因，可通過(guò)直接或間接作用促使細(xì)胞凋亡，從而可防止癌變的發(fā)生。miR-139-5p 不僅能與DNA 結(jié)合參與基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控，還能起到反式激活的作用，因此miR-139-5p 在調(diào)控細(xì)胞周期、加速細(xì)胞凋亡等多方面作用突出。雖然現(xiàn)階段臨床上對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，亦取得了一定的成效，但尚未達(dá)到預(yù)期，仍需進(jìn)行更為深入的研究。本文主要是探討miR-139-5p 靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文的研究對(duì)象是近年來(lái)在我院進(jìn)行手術(shù)治療的30 例原發(fā)性肝癌患者。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：病情符合原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)檢查得到確診；首次發(fā)?。煌ㄟ^(guò)手術(shù)將腫瘤切除；術(shù)前未接受過(guò)其他抗腫瘤治療；自愿參與本研究，并簽署了知情同意書(shū)。在這些患者中，有男性24例，女性6 例；其年齡為34 ～75 歲，平均年齡為（57.69±5.43）歲；其中，腫瘤TNM 分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者有17 例，為Ⅲ期和Ⅳ期的患者有13 例；肝癌組織學(xué)分類為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）、腺鱗癌的患者分別有15 例、12 例、3 例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與處理 分別采集30 例患者和健康體檢者的空腹靜脈血4 mL，迅速注入EDTA采血管中，輕輕混勻。在4℃下對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行10 min 的離心處理（轉(zhuǎn)速為3500 r/min），取上清液，并將其置于-80℃的冰箱中保存待用。

1.2.2 血漿中總RNA 的提取 分別吸取上述血漿樣本250 μL，加入750 μL 的Trizol 試劑，混勻后加入氯仿、異丙醇等試劑，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA。測(cè)定總RNA 純度合格后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)后產(chǎn)物cDNA 置于-20℃的冰箱中保存待用。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）合成cDNA 后，用Roche 公司生產(chǎn)的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒 光 定 量PCR 試劑盒來(lái)擴(kuò)增目的基因，U6 為內(nèi)參基因。血漿miRNA 含量采用相對(duì)表達(dá)量2- △△Ct 表示。

1.2.5 結(jié)果判定 TGF-β1判定：1）陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度：棕黃色記3 分，黃色記2 分，淡黃色記1 分，無(wú)色記0 分。2）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：大于75% 記3 分，介于50%～75%之間記2 分，介于25%～50%（不含50%）之間記1 分，小于25% 記0 分。3）上述兩項(xiàng)結(jié)果之和：6 分記（+++），4 ～5 分記（++），（++）與（+++）考慮為高表達(dá)；2 ～3 分記（+），0 ～1 分記（-），（-）和（+）考慮為低表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較TGF-β1在肝癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率。觀察肝癌組織與癌旁組織中miR-139-5p、TGF-β1的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料（本研究中所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布）用±s表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 在肝癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率

30 例患者肝癌組織中TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%，其癌旁組織中TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率為13.33%，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 TGF-β1 在肝癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率[例（%）]

2.2 肝癌組織與癌旁組織中miR-139-5p、TGF-β1 的表達(dá)情況

miR-139-5p 在癌旁組織中呈高表達(dá)，在肝癌組織中呈低表達(dá)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1。TGF-β1在肝癌組織中呈高表達(dá)，在癌旁組織中呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 miR-139-5p 的相對(duì)值

圖2 TGF-β1 的表達(dá)水平

圖3 TGF-β1 的相對(duì)灰度值

3 討論

肝癌是一種發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。早期肝癌患者通常無(wú)特異性癥狀，中晚期肝癌患者隨著腫瘤的快速生長(zhǎng)及肝包膜的逐漸擴(kuò)增，可出現(xiàn)肝區(qū)疼痛（主要為刺痛、持續(xù)性鈍痛）、腹脹、納差、乏力、消瘦、腹部包塊等癥狀。研究指出，肝癌患者在出現(xiàn)典型的肝區(qū)疼痛癥狀時(shí)多已失去了最佳的治療時(shí)機(jī)，其病灶完全切除率不足30%[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，常涉及相關(guān)基因的異常表達(dá)及諸多信號(hào)通路的改變。肝臟是人體合成和分泌TGF-β1的主要器官。TGF-β1是一種生物介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等多種功能，在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究指出，在肝炎病毒或炎癥反應(yīng)的反復(fù)刺激下，TGF-β1的水平可顯著升高。TGF-β1可通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)基因共同被激活，同時(shí)減少膠原酶、基質(zhì)纖溶酶等胞外基質(zhì)酶的生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮- 間葉轉(zhuǎn)化（EMT），促進(jìn)成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞粘附蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究的結(jié)果顯示，30 例患者肝癌組織中TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%，其癌旁組織中TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率為13.33%，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這充分證實(shí)了TGF-β1與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs是長(zhǎng)度為20 ～25 個(gè)核苷酸，其在動(dòng)植物中起著重要的基因調(diào)節(jié)作用，是非編碼RNA 家族的關(guān)鍵成員。miRNAs 對(duì)靶mRNA 的調(diào)控主要是通過(guò)與其3’端非編碼區(qū)域（3’-UTR）結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。成熟miRNA 的形成經(jīng)歷了一系列復(fù)雜的過(guò)程。首先，miRNA 被核內(nèi)的RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初級(jí)miRNA（pri-miR-NAs），隨后RNase Ⅲ型內(nèi)切酶drosha 再次切割pri-miRNAs，從而產(chǎn)生具有約70 個(gè)核苷酸和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNAs（Pre-miRNAs）。Exportin-5 將Pre-miRNAs 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后，經(jīng)RNase Ⅲ型內(nèi)切酶Dicer 處理產(chǎn)生帶有兩條鏈的miR-NA 蛋白復(fù)合物，其中一條鏈將發(fā)展為成熟的miRNA，與RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合，并以目標(biāo)mRNAs的3’-UTR 為靶點(diǎn)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p 與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。miR-139-5p 可進(jìn)行染色質(zhì)修飾并沉默多個(gè)靶基因的表達(dá)是通過(guò)對(duì)多梳蛋白抑制復(fù)合體 2 （PRC2）的募集實(shí)現(xiàn)的。隨著肝硬化向肝癌的進(jìn)展，miR-139-5p 可調(diào)控其下游的靶基因IGF1R、ROCK2 等，對(duì)抑癌因子RBI 的表達(dá)起到促進(jìn)作用，使E 鈣粘蛋白從腫瘤細(xì)胞處脫落，進(jìn)而降低了肝癌細(xì)胞中HOTAIR 的表達(dá)，阻斷腫瘤組織中的Notch 信號(hào)通路，抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究的結(jié)果顯示，miR-139-5p 在癌旁組織中呈高表達(dá)，在肝癌組織中呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TGF-β1在肝癌組織中呈高表達(dá)，在癌旁組織中呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢?jiàn)，miR-139-5p 可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。