霍山石斛對Lewis肺癌和原發(fā)性肺癌的抑制作用及機制研究

曹培常, 鄭士宏, 任薈蓉, 翁海燕, 韓際宏, 余茂耘

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.重大疾病代謝及營養(yǎng)調(diào)控安徽普通高校重點實驗室,安徽 合肥 230601; 3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院),安徽 合肥 230001; 4.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快,對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,約占全世界癌癥死亡人數(shù)的28%。從臨床角度出發(fā),結(jié)合生物學(xué)特點,可以將肺癌劃分為非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)。其中非小細胞肺癌占所有肺癌病例的85%～90%,并且非小細胞肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時一般均處于晚期,治愈幾率大幅度降低[1-2]。盡管在過去的十多年中,肺癌的早期檢測和化學(xué)治療取得了重大進展,但Ⅳ期非小細胞肺癌患者的五年生存率[3]不到1% 。

核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)廣泛參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,其異常表達會導(dǎo)致機體免疫疾病和癌癥的發(fā)生。細胞因子和病原體通過刺激細胞表面受體,如Toll樣受體4(Toll-like 4,TLR4),激活NF-κB信號通路,進而促進腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎癥因子的釋放,引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4]。NF-κB是炎癥過程的主要介質(zhì),也是腫瘤發(fā)展的驅(qū)動因素[5]。此外,NF-κB的過表達會促進肺腺癌產(chǎn)生耐藥性[6]。

肺癌的治療策略主要為手術(shù)、放療和化療,而化療被認為是所有肺癌的主要治療方法。但隨著化療的進行,癌細胞會產(chǎn)生耐藥性,主要的機制是繼發(fā)性表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)T790M突變,蛋氨酸(methionine)擴增和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[7-8],因此新型抗癌藥物越來越受到關(guān)注。近年來,天然產(chǎn)物成為抗癌候選藥物,與傳統(tǒng)抗癌藥物相比,中藥可作用于多個靶標(biāo)而殺死癌細胞且副作用很小[9-10]。

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)俗稱米斛,是一種特殊的蘭科屬物種[11]。該藥草始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》,在歷代本草文獻中都有記載[12],并被收錄至2020版《中國藥典》?；羯绞哂卸喾N有效成分,包括多糖、生物堿、酚、氨基酸、類黃酮等[13],因此其藥理活性受到廣泛研究。在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn),石斛在抗炎、提高免疫力、抗腫瘤等方面都具有優(yōu)良表現(xiàn)。目前,關(guān)于霍山石斛抗腫瘤的報道較少,且動物模型大多為皮下移植瘤模型。因此,本實驗建立Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC1)和原發(fā)性肺癌2種小鼠肺癌模型,并著重探究霍山石斛對尿烷誘導(dǎo)的原發(fā)性肺癌的治療效果和作用機制。此外,本實驗使用厄洛替尼作為陽性對照藥物,以判定石斛的抗腫瘤效果,并將厄洛替尼與霍山石斛聯(lián)合處理,旨在探究霍山石斛與厄洛替尼是否具有協(xié)同作用。

1 實驗材料

1.1 主要藥品與試劑

霍山石斛(安徽同濟生生物科技有限公司);厄洛替尼(MCE),貨號:HY-50896;尿烷(Sigma),貨號:U2500-100G;蘇木素染液(索萊寶),貨號:H8070-10g;伊紅染液(Biosharp),貨號:BL703B;DMEM培養(yǎng)基(Corning Subsidiary),貨號:27017008;NF-κB單克隆抗體(Abclonal),貨號:A16271;TLR4單克隆抗體(Proteintech),貨號:19811-1-AP;β-actin單克隆抗體(Abclonal),貨號:AC026;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京維諾贊生物科技有限公司),貨號:R123-01;TNF-α ELISA試劑盒(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司),貨號:SEK50349。

1.2 動物和細胞

6～8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠20只、6～8周齡BALB/c雄性小鼠40只,均購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXX(蘇)2019-0008;LLC1細胞購于ATCC。

2 實驗方法

2.1 動物實驗分組及給藥情況

6～8周齡C57BL/6J小鼠,共20只,隨機分為對照組、石斛組、厄洛替尼組、藥物聯(lián)用組,每組5只;6～8周齡BALB/c小鼠,共40只,分組方式同上,每組10只。

厄洛替尼每天給藥量為50 mg/kg。根據(jù)《中國藥典》(2015版)鮮石斛每天給藥量為5 g/kg。

2.2 動物模型建立

2.2.1 Lewis肺癌模型

LLC1細胞體外培養(yǎng)至足夠數(shù)目后,用胰酶消化為懸浮細胞,并用預(yù)冷 PBS 清洗2遍。剃除小鼠右肋附近毛發(fā),在肋皮下注射100 μL(1×106個LLC1細胞)細胞懸液。待小鼠皮下成瘤后,每2天測量1次腫瘤最長和最短的直徑。21 d后實驗結(jié)束。小鼠安樂死后,取出相應(yīng)組織。腫瘤體積的計算公式為V=ab2/2,其中:a為腫瘤長度;b為腫瘤寬度。

2.2.2 原發(fā)性肺癌模型

將4組BALB/c小鼠喂食普通食物或含藥物的食物。1周后,所有小鼠腹腔注射尿烷(1 g/kg),每5 天注射1次,共注射8次。從第1次注射開始,共計60 d,在此期間記錄小鼠體質(zhì)量和生存情況。至第60 天,將存活小鼠進行安樂死,取出相應(yīng)組織。

2.3 H&E染色

腫瘤組織脫水、包埋后切取5 μm石蠟切片,使用二甲苯進行脫蠟處理(2×10 min),并分別在100%、95%、90%、80%、70%的乙醇中水化處理5 min。蘇木素染液染色1 min后,用蒸餾水漂洗5 min。然后在伊紅染液中染色2 min,再用蒸餾水漂洗5 min。隨后依次在70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中浸泡5 min,最后在二甲苯中浸泡(2×10 min)后,封片,晾干。用顯微鏡獲取染色圖像,然后使用Image J軟件統(tǒng)計癌變面積。

2.4 免疫組化

首先將5 μm石蠟切片進行脫蠟與水化處理,然后使用0.1% Trion X-100孵育5 min進行破膜處理,PBS洗滌3次。使用3%的H2O2室溫孵育10 min,PBS洗滌3次。將切片放入檸檬酸鈉溶液(0.01 mol/L,pH值為 6.0)中于95 ℃加熱20 min進行抗原修復(fù)。冷卻至室溫后將切片用山羊血清封閉15 min,然后用相應(yīng)一抗在4 ℃孵育過夜。洗滌去除一抗后,使用生物素標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG室溫孵育10 min,PBS洗滌3次,然后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液于室溫孵育10 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色完成后,再用蘇木素復(fù)染切片,脫水封片,充分干燥后用顯微鏡獲取圖像,然后使用Image J軟件統(tǒng)計陽性區(qū)域面積。

2.5 支氣管肺泡灌洗液的獲取和處理

剖開小鼠胸腔,露出肺部,剪開頸部皮層,露出氣管。將留置針插入氣管中,并用縫合線系緊,以固定留置針。隨后通過留置針向肺部注入1 mL無菌PBS,再抽出至EP管中,反復(fù)3次。隨后用縫合線系住肺部一角,注入1 mL 4%多聚甲醛。被縫合線系住的部分肺組織用于提取蛋白質(zhì)和RNA,剩余部分置于多聚甲醛中固定。

支氣管肺泡灌洗液的后續(xù)處理:將灌洗液在4 ℃下1 000 r/min離心10 min,然后用200 μL無菌PBS重懸細胞沉淀,其中3×50 μL用于涂片,剩余的進行細胞計數(shù)。涂片晾干之后,用4%多聚甲醛固定10 min,再用蒸餾水沖洗。最后使用H&E染色,晾干后用顯微鏡獲取圖像。

2.6 組織總RNA提取和實時熒光定量PCR

將30 mg組織用500 μL RNA提取試劑研磨后,加入100 μL三氯甲烷,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液至新管。加入等體積異丙醇,吹勻后放在-20 ℃過夜沉降。次日離心后,除去上清液。依次用500 μL 75%、100%乙醇清洗RNA沉淀。待乙醇完全揮發(fā)后加入60 ℃無菌水溶解RNA并測量質(zhì)量濃度。隨后取1 μg RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄實驗得到cDNA,用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)。所用引物見表1所列。

表1 引物序列

2.7 Western Blot檢測

將30 mg組織同裂解液研磨后,4 ℃ 離心機12 000 r/min離心10 min,取上清液至新管。然后用BCA法測定總蛋白質(zhì)量濃度。定量60 μg的總蛋白于100 ℃加熱變性5 min后,在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳、轉(zhuǎn)膜。根據(jù)相應(yīng)蛋白分子量剪下目的條帶,用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,再與相應(yīng)一抗(NF-κB、TLR4、β-actin)于4 ℃過夜孵育。PBST洗滌3次后用二抗孵育60 min,再用PBST洗滌3次。然后通過ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒在成像設(shè)備中進行檢測。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,使用GraphPad Prism 7 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用t檢驗方法分析各組間顯著性差異。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 實驗結(jié)果

3.1 霍山石斛對小鼠LLC1的抑制作用

為了探究霍山石斛是否能抑制NSCLC腫瘤以及霍山石斛與厄洛替尼是否具有協(xié)同作用,本實驗將小鼠隨機分成4組,皮下注射LLC1細胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型?；羯绞种菩∈竽[瘤的發(fā)生和發(fā)展結(jié)果如圖1所示。

圖1 霍山石斛抑制小鼠腫瘤的發(fā)生和發(fā)展情況

從圖1a可以看出,在注射后第4 天,對照組小鼠已全部長出腫瘤,而霍山石斛和厄洛替尼組均能明顯推遲腫瘤的成瘤時間。由圖1b可知,石斛組和厄洛替尼組小鼠腫瘤體積顯著低于對照組,然而藥物聯(lián)用組并沒體現(xiàn)出疊加效應(yīng),表明在該模型下,霍山石斛能有效抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,且效果與厄洛替尼類似,但是兩者并無協(xié)同作用。

3.2 霍山石斛對小鼠生存率和癌變的影響

尿烷是一種強效致肺癌物質(zhì),存在于煙葉和煙草煙霧中[14]。該藥物處理的小鼠能在2個月內(nèi)形成腫瘤結(jié)節(jié),形成的腫瘤是上皮惡性腫瘤,與人類腺癌具有一致性[15]。因為尿烷誘導(dǎo)肺部發(fā)生癌變的過程與人類肺癌的發(fā)病過程相近,所以尿烷被廣泛用于原發(fā)性肺癌模型的構(gòu)建[16]。尿烷能誘發(fā)肺部炎癥并導(dǎo)致小鼠死亡，因此本實驗探究霍山石斛能否抑制原發(fā)性肺癌的發(fā)生并改善小鼠生存狀況,結(jié)果如圖2所示。

圖2 霍山石斛提高BALB/c小鼠生存率

從圖2可以看出,對照組死亡6只小鼠,其余組皆死亡2只小鼠,表明藥物處理組小鼠生存活率高于對照組,然而根據(jù)Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗可知,只有石斛組具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。表明霍山石斛對尿烷處理小鼠具有保護作用,能夠改善小鼠生存狀況。

小鼠肺部組織H&E染色結(jié)果如圖3所示,其癌變面積如圖4所示。

圖3 小鼠肺部組織H&E染色染色結(jié)果

圖4 霍山石斛抑制尿烷誘導(dǎo)肺部癌變面積占比

由圖4可以看出,3個藥物處理組小鼠的肺部腺癌面積均明顯減少,表明霍山石斛能有效抑制尿烷誘導(dǎo)的肺部癌變。

3.3 霍山石斛對癌變組織增殖的抑制作用

Ki-67作為癌細胞增殖標(biāo)志物,它的高表達預(yù)示著癌變組織細胞的過度增殖。對小鼠肺部組織進行免疫組化檢測,結(jié)果如圖5所示,霍山石斛抑制小鼠肺部Ki-67表達和mRNA水平如圖6所示。

圖5 免疫組化分析結(jié)果

圖6 霍山石斛抑制癌變組織Ki-67表達及mRNA水平

從圖6可以看出,霍山石斛明顯抑制Ki-67蛋白表達,霍山石斛顯著降低肺部組織Ki-67的mRNA水平。結(jié)果表明，霍山石斛能顯著抑制尿烷誘發(fā)的原發(fā)性肺癌和肺部細胞異常增殖。在該模型下,霍山石斛比厄洛替尼具有更佳的抑增殖效果,但是藥物聯(lián)用后沒有明顯的疊加效果。

3.4 霍山石斛對小鼠肺部炎癥細胞募集的阻止

肺部持續(xù)暴露于炎性環(huán)境,會導(dǎo)致正常組織細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞。肺部炎癥多由中性粒細胞(NEU)、淋巴細胞(LYM)和巨噬細胞(MQ)引發(fā),而中性粒細胞也能夠促進癌細胞轉(zhuǎn)移[17]。因此，為了明確霍山石斛抑制尿烷誘導(dǎo)的原發(fā)性肺癌的機制,本實驗提取小鼠支氣管肺泡灌洗液,用血細胞計數(shù)板計算總炎癥細胞數(shù)。隨后將細胞涂片進行H&E染色,再根據(jù)細胞形態(tài)差異,分析中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的細胞數(shù)。H&E染色后顯微鏡(200倍)下的細胞形態(tài)如圖7所示,霍山石斛對小鼠肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)量的影響如圖8所示。

圖7 肺泡灌洗液涂片H&E染色

圖8 霍山石斛對小鼠肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)量的影響

從圖8可以看出,石斛組和厄洛替尼組炎癥細胞數(shù)均顯著降低,并且藥物聯(lián)用后,炎癥細胞數(shù)量減少更多,另外藥物處理均能降低中性粒細胞、淋巴細胞的數(shù)量,而巨噬細胞僅在藥物聯(lián)合處理后才顯著降低。

這表明霍山石斛抗炎效果明顯,并且能通過與厄洛替尼的聯(lián)用,更好地抑制尿烷誘導(dǎo)的肺部炎癥細胞的募集。

3.5 霍山石斛對肺部炎癥的抑制

文獻[18]表明尿烷促進炎癥因子(IL-1β、IL-6和NF-κB等)的表達而引發(fā)肺腫瘤形成。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族是炎癥過程的主要介質(zhì),并且NF-κB在多種癌癥被激活,參與癌癥進程。鑒于霍山石斛的抗炎抗腫瘤效果,本文對NF-κB信號通路進行研究。肺部組織NF-κB免疫組化如圖9所示。由圖9可知,尿烷顯著提升肺部NF-κB的表達量,而經(jīng)過藥物處理后,NF-κB表達明顯下調(diào)。

圖9 肺部組織NF-κB免疫組化

本實驗檢測肺泡灌洗液中TNF-α的質(zhì)量濃度,結(jié)果如圖10所示,由圖10可知,霍山石斛明顯降低了肺泡灌洗液中TNF-α的水平,而厄洛替尼組無明顯變化,并且藥物聯(lián)用組效果不顯著。

圖10 霍山石斛抑制小鼠肺泡灌洗液中TNF-α的水平

此外,本文還通過Western Blot和實時熒光定量PCR檢測NF-κB信號通路相關(guān)基因表達情況,結(jié)果如圖11、圖12所示,從圖11、圖12可看出,霍山石斛能明顯抑制TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達水平;與厄洛替尼相比,霍山石斛抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β的效果更明顯;然而,霍山石斛與厄洛替尼聯(lián)用對NF-κB信號通路無疊加效應(yīng)。結(jié)果表明霍山石斛通過TLR4-NF-κB信號通路降低尿烷誘導(dǎo)的炎癥,從而抑制原發(fā)性肺癌的發(fā)展。另外,雖然霍山石斛和厄洛替尼在抑制炎癥細胞數(shù)量中具有疊加作用,但在抑制炎癥相關(guān)分子方面并無類似作用。

圖11 霍山石斛抑制TLR4和NF-κB的蛋白表達水平

圖12 霍山石斛抑制TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平

4 討 論

霍山石斛作為傳統(tǒng)藥食同源植物,具有更高的安全性和更少的副作用?；羯绞梢杂糜谌粘７?增強人體免疫力,具有很高的藥用價值。近幾年的研究表明霍山石斛具有抗腫瘤活性,但是關(guān)于肺癌特別是原發(fā)性肺癌的研究較少。本文旨在探究霍山石斛對肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用和分子機制。在本實驗2種動物模型中,霍山石斛能抑制非小細胞肺癌的發(fā)展,且抑癌效果與臨床上抗癌經(jīng)典藥物厄洛替尼相近。

炎性環(huán)境和炎癥細胞能促使正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化,促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[19]。炎癥因子的不斷分泌導(dǎo)致白細胞在肺部積累,這些炎癥的侵?jǐn)_可能會導(dǎo)致肺部發(fā)病風(fēng)險增加,包括肺癌[20]。在原發(fā)性肺癌模型實驗中,本文發(fā)現(xiàn)霍山石斛能明顯提高小鼠生存率,降低肺部炎性浸潤和癌變。另外,霍山石斛與厄洛替尼聯(lián)用能更顯著地阻止肺部炎癥細胞募集,但是對肺部炎癥因子的抑制作用并沒有疊加效應(yīng)。厄洛替尼對Lewis肺癌模型(即局部復(fù)發(fā)腫瘤模型)小鼠具有最佳的治療效果,而在原發(fā)性肺癌中,其效果不如霍山石斛。這可能是由于厄洛替尼作為表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI),主要用于治療已經(jīng)接受過化療的局部晚期和轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌,其作用機制是抑制EGFR基因上外顯子的異常缺失和突變,而抗炎并非其功效所在,但當(dāng)霍山石斛和厄洛替尼聯(lián)用時,能更顯著地抑制炎癥細胞數(shù)量,提示臨床上將兩者聯(lián)用可能會對應(yīng)晚期肺癌患者的治療具有更佳的療效。

關(guān)于石斛抗癌的報道較多,鐵皮石斛提取物通過阻斷Wnt/β-catenin途徑抑制肝癌細胞增殖并促進凋亡[21];從美花石斛中提取的金霉素能抑制癌干細胞(CSC)活性[22];來源于鐵皮石斛的聯(lián)苯芐可誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡[23];鐵皮石斛多糖通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑抑制大鼠胃癌[24];從石斛莖中提取的Lusianthridin能減弱肺癌CSC特性[25]等。上述研究大多是以石斛促凋亡、誘導(dǎo)細胞周期停滯以及抑制癌干細胞為研究重點。而本實驗旨在探究霍山石斛能否減弱腫瘤或肺組織炎性環(huán)境,從而抑制腫瘤發(fā)展。

厄洛替尼對EGFR突變陽性肺癌患者的預(yù)后有極佳的效果。但是尼古丁(煙草的成分之一)可通過促進EGFR/AKT/ERK磷酸化來誘導(dǎo)NSCLC細胞對厄洛替尼產(chǎn)生耐藥性[26-27]。另外,NF-κB的活化能促進NSCLC細胞獲得厄洛替尼和順鉑耐藥性[28-29]。無論是傳統(tǒng)的毒性藥物還是新型分子靶向藥物,都遭受耐藥性的挑戰(zhàn),耐藥性已經(jīng)成為癌癥治療失敗與癌癥相關(guān)死亡率的主要因素[30]。腫瘤的耐藥性可分為內(nèi)在性和獲得性耐藥。產(chǎn)生耐藥性的機制十分復(fù)雜,包括藥物透過組織的能力和腫瘤異質(zhì)性等。耐藥性會導(dǎo)致癌癥的惡化和復(fù)發(fā)。

因此,人們迫切需要新型藥物以解決耐藥性問題。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)天然物質(zhì)(如槲皮素、姜黃素、黃芩素等)能通過抑制耐藥性相關(guān)蛋白表達以及靶向非凋亡細胞死亡,從而降低癌細胞的耐藥性[31]。天然藥物與臨床藥物聯(lián)用來解決耐藥性問題已成為熱門研究方向。本研究證明，霍山石斛能通過抑制NF-κB信號通路降低肺部炎癥并阻止肺癌的發(fā)展。由于NF-κB參與癌細胞獲得耐藥性的過程,霍山石斛可能具有逆轉(zhuǎn)耐藥性的能力。因此將霍山石斛與其他抗癌藥物的聯(lián)合用藥以解決耐藥性問題將具有良好前景。

5 結(jié)論

本文通過建立原發(fā)性肺癌和Lewis肺癌模型,發(fā)現(xiàn)霍山石斛能通過NF-κB信號通路抑制肺部炎癥,阻止肺癌發(fā)生發(fā)展,提高存活率。本研究為霍山石斛的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。