粒毛盤(pán)菌YM405胞外多糖硒納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性

葉子揚(yáng), 張?chǎng)雾? 葉紅玲, 葉 明

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林與服裝學(xué)院,安徽 安慶 246003)

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤,也是與癌癥相關(guān)死亡的三大主要原因之一,每年約有60萬(wàn)人死亡[1-3],一些藥物治療和肝移植會(huì)引起不良反應(yīng),因此治療肝癌的方法有限[4-5]。本課題組前期的研究表明粒毛盤(pán)菌(Lachnumsp.)多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。文獻(xiàn)[6]證實(shí)磷酸酯化和硫酸酯化修飾顯著增強(qiáng)了粒毛盤(pán)菌多糖對(duì)小鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞、小鼠Lewis肺癌細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。文獻(xiàn)[7]發(fā)現(xiàn)粒毛盤(pán)菌多糖通過(guò)增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)并使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M1表型抑制S180肉瘤。近年來(lái),研究者發(fā)現(xiàn)多糖-納米粒子具有良好的生物相容性、無(wú)毒且成本低,因此受到許多學(xué)者的關(guān)注[3]。但是,關(guān)于粒毛盤(pán)菌多糖在納米領(lǐng)域的應(yīng)用并不多。

硒(Se)是一種重要的微量元素,具有抗氧化、抗腫瘤及其他生物活性,與免疫調(diào)節(jié)和人類(lèi)健康密切相關(guān)[8],然而由于有效劑量和毒性劑量之間的微小差異,其生物利用度非常有限[9]。零價(jià)紅色硒納米粒子(SE0NPs)由于其多價(jià)氧化還原能力和不同形式硒的生物安全性而具有獨(dú)特的特性[10-11]。因?yàn)榧{米硒在氧化還原及清除自由基的能力方面具有尺度效應(yīng),其粒徑越小,抗氧化能力越強(qiáng),所以需要在納米硒表面加以修飾,以阻止納米粒子的聚集[12]。

本研究選用粒毛盤(pán)菌YM405胞外多糖LEP-2b和Na2SeO3為原料,采用抗壞血酸還原法制備LEP2b-SeNPs,并研究其抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

粒毛盤(pán)菌YM405菌株的子實(shí)體采自中國(guó)云南省,由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離并保藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粒毛盤(pán)菌YM405胞外多糖的分離純化

參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改,配制發(fā)酵培養(yǎng)基。接種粒毛盤(pán)菌YM405后,以100 r/min速度攪拌、30 ℃恒溫發(fā)酵6 d。抽濾、濃縮、醇沉,離心取沉淀即得粗多糖。用水將其復(fù)溶后,加1/10體積的30%雙氧水至粗多糖溶液中,50 ℃恒溫至溶液無(wú)色。采用Sevag法脫蛋白,即向粗多糖水溶液中加入1/3體積的氯仿-正丁醇(兩者體積比為5∶1)混合溶液,劇烈震蕩20 min后靜置至溶液分層,取上層多糖溶液,重復(fù)上述步驟多次直至靜置后可分為兩層清澈的溶液。透析48 h,濃縮后于-50 ℃冷凍干燥24 h。

用雙蒸水配制成0.1 g/mL的多糖溶液,進(jìn)DEAE-cellulose 52 色譜柱,以0.3 mol/L NaCl洗脫,洗脫流速為0.5 mL/min。然后,采用苯酚硫酸法,490 nm處所測(cè)吸光度表示每管洗脫液中的多糖含量。以管數(shù)為橫坐標(biāo),A490為縱坐標(biāo),作洗脫曲線(xiàn)。根據(jù)洗脫曲線(xiàn)確定洗脫峰對(duì)應(yīng)的收集管,分別收集相應(yīng)洗脫液流出組分后透析24 h、濃縮、凍干。用雙蒸水將上述多糖干粉配制成0.1 g/mL的多糖溶液,進(jìn)Sepharose CL-6B色譜柱,用0.9% NaCl洗脫,洗脫液流速為0.5 mL/min,按上述方法做洗脫曲線(xiàn),并收集分級(jí)分離后的主要組分,透析24 h、濃縮、凍干。

1.2.2 LEP2b-SeNPs的制備和表征

參考文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改。將不同質(zhì)量濃度的LEP-2b粉末溶于100 mL超純水中制備LEP-2b溶液,新鮮制備40 mmol/L抗壞血酸溶液,在磁力攪拌下將LEP-2b溶液滴加到1 mL亞硒酸鈉溶液(100 mmol/L)中,然后將10 mL 40 mmol/L抗壞血酸溶液添加到混合物中,反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液移至透析袋中,置于蒸餾水中于4 ℃條件下避光透析24 h,每隔2 h換1次蒸餾水,透析產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥所得樣品即為L(zhǎng)EP2b-SeNPs,避光保存?zhèn)溆谩?/p>

用膠頭滴管滴加2滴LEP2b-SeNPs溶液到日立HT-7700 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)專(zhuān)用銅網(wǎng)上,置于40 ℃烘箱內(nèi)干燥后,放在TEM上進(jìn)行觀(guān)察。將LEP2b-SeNPs配制成不同質(zhì)量濃度的懸浮液,利用納米粒度儀檢測(cè)粒徑分布。將LEP2b-SeNPs存儲(chǔ)在4、25 ℃、60 d以確定其穩(wěn)定性。

1.2.3 H22荷瘤小鼠模型建立

雄性ICR小鼠58只,體質(zhì)量為(20±2) g,購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為(23±2) ℃,濕度為(55±5)%,光照/黑暗周期為12 h。購(gòu)置后,將小鼠先放置在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,在此期間給小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水,所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照合肥工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所建立的準(zhǔn)則進(jìn)行。

參照文獻(xiàn)[15]的方法并略作修改。將H22細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d,使其細(xì)胞活性達(dá)到最高后在1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 min,然后用PBS洗滌3次,收集細(xì)胞。然后用無(wú)菌生理鹽水將H22細(xì)胞密度調(diào)整至2×106個(gè)/mL,吹打均勻,制成細(xì)胞懸液。選取10只小鼠,腹腔注射H22細(xì)胞懸液(0.2 mL/只)進(jìn)行細(xì)胞體內(nèi)增殖。將小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后,將腹水形成良好的小鼠用乙醚麻醉,全身消毒后,在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中用注射器吸出腹水。吸出的腹水在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,獲得細(xì)胞沉淀,用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀3次,制成建模用細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/mL)。選取32只健康小鼠,將建模用細(xì)胞懸液以0.2 mL/只的劑量接種到小鼠的右腋下，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)4 d后選取腫瘤直徑在0.5 cm左右的小鼠作為H22荷瘤模型小鼠。

低劑量LEP2b-SeNPs處理組(L組):尾靜脈注射750 μg/(kg·d)的LEP2b-SeNPs;高劑量LEP2b-SeNPs處理組(H組):尾靜脈注射2 500 μg/(kg·d)的LEP2b-SeNPs;陽(yáng)性藥物組(5-Fu組):尾靜脈注射50 mg/(kg·d)的5-氟尿嘧啶;毒性組(D組):對(duì)正常小鼠的尾靜脈注射2 500 μg/(kg·d)的LEP2b-SeNPs;空白對(duì)照組(N組)和模型對(duì)照組(M組):每天尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。

每天記錄小鼠的攝食量、體質(zhì)量及行為變化。在末次處理后,將小鼠禁食1夜。乙醚麻醉后,摘除眼球收集的血液于無(wú)菌離心管中,最后將小鼠脫頸處死。小鼠死亡后,立即對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,用生理鹽水(4 ℃)清洗后,將上述各組織的一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分經(jīng)液氮迅速冷凍后,保存于-80 ℃冰箱。無(wú)菌離心管中的血液一部分用于血細(xì)胞分析,另一部分待血液凝固后,將其在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min分離血清,分離后的血清保存在-80 ℃冰箱,備用。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法并稍作修改。免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行(Dako LSAB試劑盒,Carpinteria)。將玻片在10 mmol/L檸檬酸鈉(pH值為6.0)中煮沸30 min進(jìn)行抗原修復(fù),再將載玻片與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后,將玻片與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗一起孵育,在3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)中顯影,用蘇木精復(fù)染,并固定在樹(shù)脂中。

1.2.5 生化指標(biāo)的測(cè)定

用冷的生理鹽水以1∶9(肝的質(zhì)量與鹽水體積)的比例勻漿肝組織,離心(2 500g,10 min),并收集上清液。使用生化試劑盒測(cè)定血清中谷草轉(zhuǎn)氫酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)的活性;肝臟中過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的活性,用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和γ-干擾素(IFN-γ)的水平。以上均依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。單向方差分析(ANOVA)用于確定組間數(shù)據(jù)的顯著性水平。若P<0.05，則認(rèn)為組間存在顯著性差異。與模型組相比，*P<0.05具有顯著差異;與正常組相比，#P<0.05 具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEP2b-SeNPs的制備及表征結(jié)果分析

納米顆粒的粒徑和穩(wěn)定性對(duì)于細(xì)胞攝取影響很大[17-18]。本文制備的LEP2b-SeNPs如圖1所示,粒徑隨LEP-2b質(zhì)量濃度的變化情況如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)LEP-2b的質(zhì)量濃度為0～0.48 mg/mL時(shí),SeNPs的粒徑隨質(zhì)量濃度的增加而減小;當(dāng)添加的LEP-2b質(zhì)量濃度為0.48～0.80 mg/mL時(shí),粒徑大小趨于增大,表明SeNPs的粒徑與LEP-2b的質(zhì)量濃度有關(guān)。

圖1 制備的LEP2b-SeNPs=

圖2 SeNPs的粒徑與LEP-2b質(zhì)量濃度的關(guān)系

利用納米粒度儀測(cè)定SeNPs和LEP2b-SeNPs的粒徑分布范圍，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,未修飾的SeNPs的平均粒徑為620.5 nm,而用0.48 mg/mLLEP-2b制備的LEP2b-SeNPs粒徑大小均一,集中分布在較窄的區(qū)域,平均粒徑顯著減小,小于100 nm,表明合成的LEP2b-SeNPs粒子具有良好的納米尺度。SeNPs和LEP2b-SeNPs(反應(yīng)時(shí)添加0.48 mg/mL LEP-2b)的粒徑分布分別為220.20～1 281.00 nm和32.67～220.20 nm。

(a) SeNPs

(b) LEP2b-SeNP圖3 SeNPs和LEP2b-SeNP的粒徑分布

制備的LEP2b-SeNPs溶液在4、25 ℃下放置2個(gè)月后呈透明紅色液體,無(wú)明顯聚集和沉淀,而SeNPs沉淀明顯,表明LEP2b-SeNPs比SeNPs具有更好的穩(wěn)定性。SeNPs和LEP2b-SeNPs的TEM圖如圖4所示。由圖4可知,在沒(méi)有LEP-2b的情況下,SeNPs傾向于聚集和沉淀,而用0.48 mg/mL LEP-2b制備的LEP2b-SeNPs分散均勻。

圖4 SeNPs和LEP2b-SeNPs的TEM圖

2.2 LEP2b-SeNPs對(duì)小鼠的影響

通過(guò)小鼠腋下皮下注射H22腫瘤細(xì)胞建立移植實(shí)體瘤模型,評(píng)價(jià)LEP2b-SeNPs對(duì)小鼠肝癌的作用。不同處理組小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量如圖5所示。從圖5可以看出,對(duì)各組小鼠處理9 d后,在所有處理組中均觀(guān)察到腫瘤體積減小,發(fā)現(xiàn)低劑量比高劑量LEP2b-SeNPs對(duì)小鼠移植性腫瘤顯示出更加明顯的抑制作用,低劑量LEP2b-SeNPs和陽(yáng)性藥組的小鼠瘤質(zhì)量與模型組相比差異極其顯著(P<0.001)。

圖5 不同處理組小鼠的腫瘤質(zhì)量

不同處理組干預(yù)期間小鼠的體質(zhì)量及攝食量隨天數(shù)的變化如圖6所示。由圖6可知,正常組和單獨(dú)使用LEP2b-SeNPs(D組)的小鼠精神狀態(tài)良好,體質(zhì)量較平穩(wěn),毛發(fā)光亮,無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生,表明小鼠對(duì)LEP2b-SeNPs的劑量具有良好的耐受性;模型組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中絕大部分精神狀態(tài)不佳,小鼠體質(zhì)量由于荷瘤也有所增加;在5-Fu處理后,小鼠的體質(zhì)量相較于模型組顯著下降,且表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩、神情呆滯,說(shuō)明5-Fu可能對(duì)小鼠造成副作用;與模型組相比,LEP2b-SeNPs組小鼠活躍,精神狀態(tài)良好,但體質(zhì)量增加不明顯。另外,在攝食量方面,正常組小鼠的食物攝取隨體質(zhì)量增加。然而,模型組和5-Fu組的小鼠食物攝入量隨天數(shù)減少,而LEP2b-SeNPs組小鼠的食物攝入量相對(duì)穩(wěn)定。

圖6 不同處理組小鼠的體質(zhì)量及攝食量隨時(shí)間的變化

2.3 對(duì)H22荷瘤小鼠蛋白表達(dá)的影響

Ki-67主要用于判斷細(xì)胞的增殖活性[19],因此采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)荷瘤小鼠腫瘤中Ki-67的表達(dá)水平,結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 不同處理組小鼠腫瘤Ki-67的免疫組織化學(xué)結(jié)果

從圖7、圖8可看出,模型組小鼠的腫瘤Ki-67表達(dá)很強(qiáng),與模型組相比,低劑量LEP2b-SeNPs組的小鼠腫瘤細(xì)胞核中觀(guān)察到弱陽(yáng)性信號(hào)(P<0.01),比高劑量組顯著性高(P<0.05),這說(shuō)明低劑量LEP2b-SeNPs有效抑制了癌細(xì)胞增殖。

圖8 不同處理組小鼠腫瘤Ki-67的IOD值

2.4 LEP2b-SeNPs對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

本文檢測(cè)H22荷瘤小鼠血清中的免疫因子(包括TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-1β),不同處理組小鼠的血清、肝臟生化因子水平結(jié)果如圖9所示。

圖9 不同處理組小鼠的血清、肝臟生化因子水平

從圖9可以看出,5-Fu處理后,血清中IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α的水平發(fā)生了不同程度的下降,表明5-Fu對(duì)小鼠的免疫系統(tǒng)具有免疫抑制作用;LEP2b-SeNPs處理后,血清中IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α的水平明顯升高(P<0.05或P<0.01);同時(shí),在毒性組也發(fā)現(xiàn)了IFN-γ、IL-1β的上調(diào)。以上結(jié)果表明,LEP2b-SeNPs能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向腫瘤組織中浸潤(rùn)、提高機(jī)體免疫因子水平,激活免疫系統(tǒng)。

通過(guò)試劑盒檢測(cè)了肝功能損傷的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。在肝臟受損時(shí),肝細(xì)胞功能被破壞,肝細(xì)胞膜通透性增加,繼而細(xì)胞中的各種酶(包括AKP和AST),就會(huì)由細(xì)胞釋放到血清中,從而引起血清中這些酶的酶活增加[20]。結(jié)果表明,與正常組相比,模型組的小鼠血清AST和AKP水平明顯增加(P<0.01);與模型組比,低劑量的LEP2b-SeNPs和5-Fu處理可顯著降低這2個(gè)指標(biāo)的水平(P<0.01)。

CAT屬于機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度的標(biāo)志之一,其過(guò)量產(chǎn)生能加劇組織的損傷[21]。5-Fu處理降低了小鼠肝臟中CAT的活性,提高了MDA的水平,與正常組小鼠相比差異有顯著性(P<0.01),表明5-Fu破壞了機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)。與模型組相比,低劑量LEP2b-SeNPs處理提高了荷瘤小鼠肝臟中CAT水平,降低了MDA的水平(P<0.01)。以上結(jié)果表明,低劑量LEP2b-SeNPs能顯著減輕荷瘤小鼠的氧化應(yīng)激。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，LEP2b-SeNPs比SeNPs具有更小的粒徑、分散性及穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[14]發(fā)現(xiàn)納米硒桔梗多糖大小均一、分散均勻,放置2個(gè)月后仍呈透明紅色液體且基本無(wú)沉降。此外,文獻(xiàn)[22]制備的昆布多糖納米硒也是均一、球形的單分散粒子,穩(wěn)定性比未修飾的SeNPs相比大大增強(qiáng)。顯然本研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果類(lèi)似。干預(yù)期間,模型組小鼠體質(zhì)量明顯上升,陽(yáng)性藥物組的小鼠體質(zhì)量顯著降低,模型組和陽(yáng)性藥物組的小鼠食物攝入量隨天數(shù)明顯下降,而LEP2b-SeNPs處理組小鼠的體質(zhì)量和食物攝入量相對(duì)穩(wěn)定。低劑量LEP2b-SeNPs的體內(nèi)抗腫瘤活性大于高劑量組,原因可能是低劑量LEP2b-SeNPs有效抑制了小鼠腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞的增殖,增加血清中的免疫因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α)的質(zhì)量濃度,繼而激活抗腫瘤免疫系統(tǒng)從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。低劑量LEP2b-SeNPs還可降低荷瘤小鼠血清AST、AKP水平,降低肝臟MDA,提高肝臟CAT水平,說(shuō)明它可以增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性,減輕氧化應(yīng)激。因此,本研究發(fā)現(xiàn)了一種新的可用于制備納米硒的材料粒毛盤(pán)菌多糖,從而拓寬了粒毛盤(pán)菌多糖的應(yīng)用范圍。為開(kāi)發(fā)粒毛盤(pán)菌多糖新型抗腫瘤產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù),也為其他活性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。