粒毛盤菌YM156多酚對二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝損傷的保護作用

陳婷婷, 何雅玲, 葉紅玲, 葉 明

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林與服裝學(xué)院,安徽 安慶 246003)

肝臟疾病包括藥物性肝損傷、酒精性肝損傷和肝癌等,是世界上發(fā)病率和死亡率較高的一類疾病,并給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[1]。二乙基亞硝胺(NDEA)作為一種致癌物質(zhì),存在于生活的各個方面,如化妝品[2]、食品[3]、自來水[4]等。NDEA在體內(nèi)可以引起氧化損傷、代謝紊亂、肝損傷等多種病理現(xiàn)象[5-6]。多酚作為一種具有抗氧化能力的次級代謝產(chǎn)物[7],其生物活性繁多,作為藥物治療肝臟疾病有一定的研究基礎(chǔ)[8]。

粒毛盤菌屬(LachnumRetz.)作為一種重要的真菌資源,生長周期短、易培養(yǎng)、代謝物種類多。有研究者從粒毛盤菌菌絲體及發(fā)酵液中提取出多種活性物質(zhì),如異香豆素衍生物[9]、多糖[10]以及多酚類化合物[11],并發(fā)現(xiàn)其多酚提取物具有抗凝血、抗氧化等作用[11-12]。但是,有關(guān)粒毛盤菌多酚對肝臟疾病是否具有預(yù)防或治療作用的報道并不多。因此,本文對粒毛盤菌YM156進行深層發(fā)酵,利用70%的乙醇溶液提取菌絲體中的多酚類物質(zhì),并采用NDEA誘導(dǎo)昆明小鼠建立肝損傷模型,研究粒毛盤菌多酚對肝損傷的保護作用,為粒毛盤菌的利用與發(fā)展提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

粒毛盤菌(Lachnum)YM156采集和分離自中國黃山,并保存于合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室。

1.2 YM156胞內(nèi)多酚的發(fā)酵、提純與測定

1.2.1 YM156胞內(nèi)多酚的發(fā)酵

采用100 L全自動發(fā)酵罐進行深層發(fā)酵[13]。培養(yǎng)基配方為:20 g/L葡萄糖,5 g/L酵母膏,5 g/L蛋白胨,0.81 g/L MgCl2,0.01 g/L酪氨酸。首先對發(fā)酵罐進行清潔與滅菌,配置70 L的發(fā)酵液加入罐中,并加入消泡劑(50 mL色拉油)。于121 ℃再次滅菌20 min,冷卻至30 ℃時接入菌種,發(fā)酵條件為:轉(zhuǎn)速200 r/min,溫度30 ℃,時間8 d。

1.2.2 YM156胞內(nèi)多酚的提純

粒毛盤菌YM156發(fā)酵結(jié)束后,對發(fā)酵液進行抽濾,收集菌絲體并在60 ℃的烘箱中干燥。將菌絲粉碎,70%乙醇浸泡提取4 h,離心、收集上清液,45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,重復(fù)3次。合并濃縮液真空冷凍干燥后,采用XAD-4型大孔樹脂對粗提物進行純化[14]。洗脫條件為:樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL,流速為2 mL/min,洗脫液為70%乙醇。收集洗脫液并除去乙醇,干燥后得到粒毛盤菌YM156多酚提取物(LSP156),并保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 YM156胞內(nèi)多酚量的測定

采用文獻[15]的方法測定LSP156中總酚的量,其中樣品溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL?？傻没貧w方程為y=7.1x+0.043,R2=0.999。經(jīng)測定,LSP156中總酚的量為85.9 mg/g。

1.3 肝損傷模型的建立及給藥

采用清潔級昆明小鼠(雄性,20～22 g,40只),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為5組(n=8)[16]:對照組CG,NDEA模型組MG(150 mg/kg NDEA),單獨LSP156組LG(100 mg/kg LSP156),低劑量組LL(50 mg/kg LSP156和150 mg/kg NDEA),高劑量組HL(100 mg/kg LSP156和150 mg/kg NDEA)。除了對照組和NDEA模型組外,其余3組小鼠每天灌胃0.2 mL的多酚溶液,持續(xù)28 d。在第29天,對照組和單獨LSP156組腹腔注射0.1 mL的生理鹽水,剩余3組注射0.1 mL的NDEA溶液(150 mg/kg),12 h后進行眼球取血,處死后解剖得到小鼠肝臟組織,生理鹽水清洗并保存于-80 ℃冰箱。

1.4 生化指標測定

取出-80 ℃冰箱保存的小鼠肝臟,精確稱取1 g肝臟,與9 mL生理鹽水混合后勻漿并離心取上清,獲得的10%肝組織勻漿備用。眼球取血30 min后,于3 000 r/min離心10 min,取上清液獲得小鼠血清,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

肝功能指標的測定。選取合適質(zhì)量分數(shù)的肝臟組織勻漿,按照試劑盒說明書(南京建成生物科技有限公司)測定并計算谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(AKP)的活性。

氧化損傷指標的測定。首先進行預(yù)試驗確定肝臟組織勻漿的最佳質(zhì)量分數(shù),采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)檢測肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性。

血脂指標的測定。根據(jù)制造商(南京建成生物科技有限公司)的說明,通過測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)來檢測和分析小鼠的脂質(zhì)指標。

炎癥反應(yīng)指標的測定。使用ELISA試劑盒(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)測定小鼠血清中白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的質(zhì)量濃度。

肝臟勻漿中蛋白質(zhì)的測定采用BCA法試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.5 組織病理學(xué)測定

采用H&E染色法對小鼠肝臟組織進行染色并觀察其病理學(xué)[17]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析,以(平均值±標準差)表示。組間分析采用One-way ANOVA檢驗,分析統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比,*P< 0.05 具有顯著差異;與NDEA模型組相比,#P< 0.05具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LSP156對小鼠肝功能指標的影響

LSP156對小鼠體內(nèi)AST、ALT和AKP酶活力的影響如圖1所示。

圖1 LSP156對小鼠體內(nèi)AST、ALT和AKP酶活力的影響

從圖1可以看出,與對照組相比,NDEA模型組小鼠肝臟中AST、ALT和AKP顯著增高(P<0.05);在單獨LSP156組中,AST、ALT和AKP沒有顯著變化;而經(jīng)過LSP156預(yù)處理后,NDEA模型組小鼠肝臟中相關(guān)酶活性均有不同程度的降低。其中,與NDEA模型組相比,高劑量組中AST、ALT和AKP顯著性降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這種變化與文獻[18]研究結(jié)果相似。在機體中,ALT、AST和AKP是與肝臟代謝相關(guān)的細胞酶,當肝臟發(fā)生損傷時,這些酶的水平和活性受到影響[19]。在本研究中,LSP156的處理降低了小鼠肝臟中AST、ALT和AKP的活性,減輕了NDEA對小鼠肝臟的損傷,說明LSP156對肝臟具有較強的保護作用。

2.2 LSP156對小鼠體內(nèi)抗氧化酶的影響

LSP156對小鼠體內(nèi)抗氧化酶的影響如圖2所示。由圖2可知,與對照組相比,NDEA模型組中SOD和CAT降低,分別為17%和27%,說明NDEA會降低正常小鼠體內(nèi)的抗氧化酶活性,引起氧化還原失衡,導(dǎo)致氧化損傷;而使用LSP156預(yù)處理后,單獨LSP156組中抗氧化酶活性增加(無顯著差異)。與NDEA模型組相比,100 mg/kg LSP156預(yù)處理的小鼠體內(nèi)SOD增高,并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而對于CAT,不同劑量的LSP156預(yù)處理能提高其酶活力,但不具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明,LSP156能夠增強體內(nèi)抗氧化酶活性,維持氧化還原平衡,減少NDEA對小鼠的損傷。

圖2 LSP156對小鼠體內(nèi)SOD和CAT酶活力的影響

2.3 LSP156對小鼠體內(nèi)TC和TG水平的影響

各組小鼠肝臟中TC和TG濃度的變化情況如圖3所示。

圖3 LSP156對小鼠體內(nèi)TG和TC水平的影響

由圖3可知,與對照組相比,NDEA模型組中TC和TG的水平顯著升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),表明小鼠急性肝損傷會導(dǎo)致肝臟內(nèi)部TC和TG的蓄積;在低劑量和高劑量組中,LSP156降低了TC和TG的水平,并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。同時,單獨LSP156組中脂質(zhì)指標水平降低,說明LSP156對于小鼠的血脂水平具有改善作用。

2.4 LSP156對小鼠炎性因子的影響

炎癥反應(yīng)是機體中一種重要的防御機制,機體中炎癥因子的大量產(chǎn)生會導(dǎo)致肝臟損傷。LSP156對小鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α水平的影響如圖4所示。

圖4 LSP156對小鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α水平的影響

從圖4可看出,在NDEA模型組中,小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平顯著升高(P<0.05),說明NDEA刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng);在低劑量和高劑量組中,LSP156的預(yù)處理降低了小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平。結(jié)果表明，LSP156可以減輕NDEA誘導(dǎo)的肝臟炎性反應(yīng),從而對肝臟起到一定的保護作用。

2.5 LSP156對小鼠肝組織病理學(xué)的影響

NDEA不僅會導(dǎo)致肝功能受損,還會影響肝臟組織結(jié)構(gòu)。肝組織學(xué)切片(放大400倍)如圖5所示,圖5中箭頭所示為肝細胞體積增大,水樣性變、核仁增多。

圖5 肝組織學(xué)切片

由圖5可知,對照組和單獨LSP156組中小鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常,肝細胞排列緊密,界線明顯,細胞核正常;NDEA模型組中出現(xiàn)肝細胞體積增大,水樣性變,核仁增多,肝組織結(jié)構(gòu)松散以及一些小灶性壞死。而LSP156的預(yù)處理減少了NDEA導(dǎo)致的肝臟組織病變,表明LSP156顯著減輕了肝病損害。

3 討 論

多酚類物質(zhì)是自然界中最豐富的抗氧化劑,主要來源于水果、蔬菜以及一些真菌微生物等[20-21]。這些多酚類化合物可以通過不同的機制發(fā)揮其抗氧化性能,如清除自由基、改善內(nèi)源性酶防御、降低脂質(zhì)過氧化等[22]。眾所周知,氧化過程與多種疾病有關(guān),如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、糖尿病、心血管疾病以及一些炎癥疾病[23],這些均與多酚類化合物的生物學(xué)活性相關(guān)[24]。事實上,多酚類藥物治療肝臟疾病已有幾十年的歷史,并且有關(guān)體內(nèi)外的研究也已經(jīng)取得了振奮人心的結(jié)果。例如,槲皮素作為一種天然多酚類化合物,能通過抗氧化應(yīng)激和抗炎作用保護肝臟免受CCl4誘導(dǎo)的損傷[25]。此外,多酚還可以通過多種分子機制預(yù)防甚至治療肝癌[26]。

肝臟作為人體中最大的解毒和代謝器官,NDEA能夠造成肝臟損傷[16]。在本研究中,LSP156能夠減輕肝臟損傷,降低小鼠體內(nèi)ALT、AST和AKP活性。有研究表明,NDEA能夠?qū)е聶C體中氧化還原反應(yīng)失衡,減少抗氧化酶的水平[26],在機體中,SOD和CAT是2種重要的抗氧化活性酶,其中,SOD主要催化超氧陰離子自由基,而CAT催化過氧化氫,但超氧陰離子自由基和過氧化氫同屬于活性氧(reactive oxygen species,ROS)。本文發(fā)現(xiàn)不同劑量的LSP156可以提高SOD和CAT的活性,抗氧化酶活性增加,從而降低活性氧水平,維持機體平衡。與此同時,本文還研究了小鼠體內(nèi)TC和TG的水平。在機體中肝臟對脂肪、糖原等的運輸和代謝尤為重要,而LSP156則緩解NDEA導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂[27]。此外,LSP156還降低了肝損傷小鼠血清中IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度。機體中,IL-6和TNF-α是2種重要的細胞因子,在炎癥、細胞免疫等活動中起著關(guān)鍵的作用[28]。結(jié)果表明,LSP156通過提高肝功能、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、降低脂質(zhì)損傷以及抑制炎癥反應(yīng)來減輕NDEA造成的肝損傷,具有非常良好的保肝活性,但其具體的作用機制仍需進一步深入研究。