番茄紅素通過上調(diào)Beclin1-Atg 5通路激活自噬發(fā)揮對(duì)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

魏延虎，任淑婷，張可妍，趙 琳*

（1. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；2. 延安市人民醫(yī)院，陜西 延安 716000）

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致殘性損傷，嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)和感覺功能。脊髓損傷的病理生理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，脊髓繼發(fā)性損傷后的病理生理過程復(fù)雜可逆，是目前集中研究的重點(diǎn)。自噬是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)態(tài)的生理過程，是機(jī)體重要的防御及保護(hù)機(jī)制。研究［1-2］表明自噬在脊髓損傷早期顯著激活，作為繼發(fā)性脊髓損傷的重要因素在其發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。番茄紅素是一類不飽和胡蘿卜素，具有較強(qiáng)的抗氧化能力［3］，并可調(diào)節(jié)自噬［4］。近年，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用研究備受關(guān)注。本研究主要觀察番茄紅素對(duì)大鼠脊髓損傷后自噬的影響，探究番茄紅素對(duì)大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)雌性SD大鼠27只，體重210～220 g，6～8 周齡。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及實(shí)驗(yàn)組各9 只，許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001。本研究經(jīng)延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-018），實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理保護(hù)法。

1.2 藥物、試劑及儀器

番茄紅素（生產(chǎn)批號(hào)：F-003-181224，廠家：成都瑞芬思生物科技有限公司）；注射用戊巴比妥鈉（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字31020501，廠家：上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；RIPA組織裂解液（北京索萊寶生物科技公司）；Trizol 試劑（上海生工生物工程）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗Beclin1、Atg5、GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；脊髓打擊器（美國PSI 公司）；冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；PCR 儀（瑞士Roch公司）；蛋白電泳和快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國BIO-RAD）。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠脊髓損傷模型 腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉，以T10 棘突為中心在背部正中心作約2 cm 縱行切口，采用手術(shù)刀鉗開緊靠棘突兩邊的背部肌肉，假手術(shù)組大鼠僅切除T10椎板，模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠在此基礎(chǔ)上充分暴露脊髓，采用脊髓打擊器打擊脊髓，損傷力度200 kdyn/cm2。打擊后大鼠尾部痙攣性擺動(dòng)，軀體和雙后肢出現(xiàn)不同程度撲動(dòng)，隨后完全松弛為建模成功。

1.3.2 給藥方法 大鼠麻醉清醒后，實(shí)驗(yàn)組給予番茄紅素玉米油溶液20 mg/kg 灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積玉米油灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。

1.3.3 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估 分別于術(shù)后1、3、7、14 d 后采用斜板試驗(yàn)評(píng)估脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，將大鼠置于墊有橡膠墊的長形窄斜板上，大鼠身體軸線和斜板縱軸垂直放置，從0°開始，每次抬高5°觀察大鼠在斜板上能停留5 s 的最大角度，每只大鼠測量3次，取均值。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time，qRT-PCR）檢測自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5 mRNA表達(dá) 術(shù)后7 d，3組大鼠各取3只脫臼處死，暴露取出損傷段脊髓組織，稱取100 mg，提取總RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并作為模板建立反應(yīng)體系。以β-actin為內(nèi)參，引物序列如下：反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，在PCR 儀 上 進(jìn) 行40 個(gè) 循 環(huán)，通 過2－△△Ct法 計(jì) 算Beclin-1、Atg5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

基因名稱Beclin1 Atg5 β-actin正向引物（5'-3'）ATTCCTGCTTAGATGACGTA CAAAGCCATTGCAGACAT CTAAGCCTTAGCTGACTACTT反向引物（5'-3'）CGTTCATGGCTCGCTTCGTA CTAGGCAACTGAACACGT GGCATTTATAGCACCCGTCCTA

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5 的表達(dá) 取3 組術(shù)后7 d 的脊髓樣品各100 mg，加入RIPA 裂解液勻漿裂解，提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。上樣并經(jīng)SDS-PAGE濕轉(zhuǎn)法分離目的蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，室溫封閉2 h，加入Beclin1、Atg5、GAPDH 抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，加入二抗，室溫孵育2 h，洗滌3 次后采用化學(xué)發(fā)光并拍照，采用Image J 軟件計(jì)算蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠斜板角度比較

術(shù)后1、3、7、14 d，3 組之間斜板角度總體比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組和實(shí)驗(yàn)組斜板角度與假手術(shù)組比較明顯減?。≒＜0.05）；術(shù)后7、14 d，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組斜板角度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。表明番茄紅素可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

2.2 3組大鼠脊髓組織Beclin1、Atg5 mRNA表達(dá)水平

術(shù)后7 d，Beclin1 在假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.05、1.28±0.08、1.40±0.13；Atg5 在3 組的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.03、1.15±0.07、1.29±0.11，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。表明大鼠脊髓損傷后自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg5 表達(dá)升高，而番茄紅素可以促進(jìn)其表達(dá)。

圖1 Beclin1、Atg5相對(duì)表達(dá)水平

2.3 3組大鼠脊髓組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5表達(dá)水平術(shù)后7 d，Beclin1 蛋白在假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.53±0.06、0.86±0.05、1.11±0.09；Atg5 蛋白在3 組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.05、0.84±0.06、1.14±0.08；組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。提示番茄紅素可以激活自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5的表達(dá)。

表1 3組大鼠斜板角度比較（±s）

表1 3組大鼠斜板角度比較（±s）

注：a表示與假手術(shù)組比較P＜0.05，b表示與模型組比較P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組實(shí)驗(yàn)組FP 1 d 70.51±5.20 31.26±2.50a 31.51±2.43a 312.451＜0.05 3 d 71.58±5.40 32.69±2.61a 35.20±2.93a 243.712＜0.05 7 d 71.36±5.45 33.05±2.70a 42.09±3.51ab 195.172＜0.05 14 d 70.89±5.31 33.69±2.73a 47.60±3.91ab 166.463＜0.05

圖2 A：各組大鼠自噬相關(guān)蛋白Western blot檢測結(jié)果；B：Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)水平；C：Atg5蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

脊髓損傷后可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙甚至截癱，而神經(jīng)元凋亡是脊髓損傷后神經(jīng)功能障礙的重要因素。神經(jīng)損傷的相關(guān)研究表明，自噬與凋亡聯(lián)系密切［5］。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的生物學(xué)途徑，在脊髓損傷早期可通過自噬清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。番茄紅素是一種類胡蘿卜素，在天然類胡蘿卜素中抗氧化性能最強(qiáng)，是β-胡蘿卜素的2倍，是維生素E的100 倍［6］。Hu 等［3］研究證實(shí)，番茄紅素可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性和清除氧自由基，提高機(jī)體的總抗氧化能力，對(duì)脊髓損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而Zhang等［4］研究表明番茄紅素也可以通過調(diào)節(jié)自噬，恢復(fù)海馬功能障礙。黎妮等［7］研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素可顯著提高高糖誘導(dǎo)的腎小球上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）自噬水平。以上研究提示番茄紅素具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用，除高效的抗氧化能力外，還可通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮其生物學(xué)功能。而關(guān)于番茄紅素對(duì)脊髓損傷后自噬的影響卻鮮有研究報(bào)道。

Beclin1 和Atg5 是自噬相關(guān)通路的關(guān)鍵蛋白，Beclinl 可通過與PI3K形成PI3K復(fù)合體，調(diào)節(jié)Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，調(diào)節(jié)自噬活性。Beclin1是一個(gè)與Bcl-2 相連的自噬相關(guān)蛋白，參與自噬復(fù)合體的合成，促進(jìn)自噬的激活，Beclin1 高表達(dá)提示自噬水平的增加［8］。Atg5是自噬過程的重要啟動(dòng)因子，用于衡量自噬程度的關(guān)鍵蛋白［9］，Atg5的增加對(duì)于自噬小體的形成具有基礎(chǔ)性的作用。本研究qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后自噬通路相關(guān)因子Beclin1、Atg 5 在mRNA 表達(dá)和蛋白質(zhì)水平均升高，說明脊髓損傷后自噬被激活，損傷區(qū)的細(xì)胞啟動(dòng)了自噬，神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的升高可能是脊髓組織對(duì)損傷的保護(hù)性反應(yīng)；給予番茄紅素后Beclin1、Atg5進(jìn)一步高表達(dá)，提示脊髓損傷后，番茄紅素可通過提高Beclin1、Atg5的表達(dá)發(fā)揮對(duì)受損脊髓的保護(hù)作用。對(duì)比各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的變化，發(fā)現(xiàn)給予番茄紅素后，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯優(yōu)于模型組大鼠，表明番茄紅素可促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，并且番茄紅素對(duì)大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用可能是通過Beclin1-Atg5依賴性自噬通路來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，番茄紅素可能通過上調(diào)Beclin1-Atg 5通路激活自噬發(fā)揮對(duì)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步深入探究番茄紅素對(duì)脊髓損傷后自噬的影響及作用機(jī)制，將為臨床靶向治療脊髓損傷提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。